Characterization of Intact mRNA Using Ion Pair-Reversed Phase-Time of Flight-MS, Size Exclusion Chromatography-Multi Angle Light Scattering, and Charge Detection Mass Spectrometry

Význam tématu

Rychlý rozvoj mRNA vakcín zvýšil potřebu přesné analýzy intaktní mRNA, včetně identifikace nechtěných vedlejších produktů, fragmentů či agregátů. Charakterizace molekulární hmotnosti a stavu asociace mRNA je kritická pro kontrolu kvality a stabilitu léčivých i výzkumných přípravků.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na porovnání tří analytických přístupů pro stanovení intaktní hmotnosti mRNA:

• Ion Pair-Reversed Phase LC-TOF-MS (IP-RP-TOF-MS)
• Size Exclusion Chromatography s Multi Angle Light Scattering (SEC-MALS)
• Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS)

Testovány byly tři mRNA vzorky: EPO mRNA (858 nukleotidů), FLuc mRNA (1929 nt) a Cas9 mRNA (4521 nt).

Použitá instrumentace

• IP-RP-TOF-MS: UPLC H-Class Bio (Waters) s ACQUITY HSS T3 C18 kolónou (1,0 × 150 mm, 1,8 µm), mobilní fáze HFIP/DIPEA ve vodě a aketonitrilu, detekce UV (260 nm) a Synapt XS QTOF MS v negativním ESI módu.
• SEC-MALS: Waters BEH450 SEC kolóna (7,8 × 300 mm, 3,5 µm, 450 Å) s 20 mM Tris/1 M TMAC (pH 7,4), průtok 0,4 mL/min, detekce UV (260 nm) a HELEOS MALS detektor.
• CDMS: Prototyp od Megadalton Solutions s nano-ESI Triversa Nanomate (positive ion mode), ion trapping 100 ms, částicová příprava v 200 mM amonium acetátu.

Hlavní výsledky a diskuse

• EPO mRNA (oček. 283 kDa): IP-RP-TOF-MS detekovala ~245 kDa (fragmentace/mobilní fáze), SEC-MALS stanovila hlavní vrchol 283 kDa s vedlejšími signály 243 kDa a 490 kDa, CDMS naměřilo 284,9 kDa i dimer ~572 kDa.
• FLuc mRNA (oček. 533 kDa): IP-RP-TOF-MS ~625 kDa (UV saturace, možná adduktace), SEC-MALS ukázala tři vrcholy 2181, 1437 a 616 kDa (monomer/dimer/oligomery), CDMS zaznamenalo ~634 kDa, doprovázené signály nižší molekulové hmotnosti (potenciální degradační produkty).
• Cas9 mRNA (oček. 1493 kDa): IP-RP-TOF-MS mimo rozsah, SEC-MALS odhalila dva vrcholy ~1490 kDa (monomer) a ~2967 kDa (dimer), CDMS potvrdilo hlavní signál ~1480 kDa.

Výsledky ukazují dobrou konzistenci mezi SEC-MALS a CDMS napříč celým rozsahem hmotností. IP-RP-TOF-MS je omezená saturací UV detektoru a horním hmotnostním limitem TOF analyzátoru.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá stanovení intaktních hmotností mRNA pro kontrolu kvality výroby vakcín nebo genové terapie.
• Možnost detekce agregace (dimerů, oligomerů) a degradačních produktů v jednom experimentu.
• CDMS jako přímá cesta bez chromatografické separace s minimem optimalizace metody.
• SEC-MALS poskytuje robustní stanovení absolutní molární hmotnosti a informaci o heterogenitě vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj by mohl zahrnovat rozšíření hmotnostního rozsahu TOF MS, integraci víceúhlého rozptylu se separačními technikami a automatizované LC-MS platformy pro high-throughput kontrolu mRNA. CDMS má potenciál pro přímý screening komplexních mRNA formulací a rychlé hodnocení stability.

Závěr

Porovnání tří metod ukázalo, že SEC-MALS a CDMS spolehlivě měří intaktní mRNA až do několika megadaltonů, zatímco IP-RP-TOF-MS je vhodná pro menší šarže s možností saturace detektoru. CDMS vyžaduje minimální přípravu a nabízí přímé stanovení hmotnosti, ale jeho přístupnost je zatím limitována odbornou instrumentací. Další výzkum by měl objasnit příčiny rozdílů měřených hmotností a optimalizovat metody pro komplexní mRNA monomery i oligomery.