Size-Exclusion Chromatography Method for Poly(A) Tail Analysis of mRNA

Význam tématu

Poly(A) ocas mRNA je klíčový pro stabilitu in vivo, ochranu před exonukleázami a efektivní překlad v buňce. Přesné stanovení délky poly(A) ocasu je proto zásadní pro kvalitu, biologickou aktivitu a bezpečnost mRNA vakcín a terapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je představit jednoduchou, rychlou a robustní metodu na stanovení délky poly(A) ocasu využívající size-exclusion chromatografii (SEC) po enzymatické digesci RNase T1. Metoda je navržena jako doplněk k stávajícím IP-RP LC postupům.

Použitá instrumentace

• LC systém: Waters ACQUITY Premier UPLC s SM-FTN a QSM modulací
• Detekce: PDA na vlnové délce 260 nm
• Kolony:
  Protein SEC 250 Å, 4.6×150 mm, 1.7 µm
  Oligonucleotide BEH C18 300 Å, 2.1×150 mm, 1.7 µm
• Software: Empower™ v3.0
• Enzymy: RNase T1, Quick CIP

Použitá metodika

Vzorky mRNA (EPO, Fluc‐beta) o koncentraci 1 mg/ml byly diges­kovány RNase T1 (37 °C, 30 min), následovala dephosphorylace Quick CIP (rt, 30 min).

• SEC podmínky: 0.1 M fosfátový pufr pH 8, 0.2 ml/min, teplota 25 °C, injekce 1 µl
• IP-RP LC podmínky: mobilní fáze s 100 mM octylammonium acetátem, 1 % HFIP a acetonitrilem, teplota 60 °C, gradient 46→28 % A v 40 min
• Kalibrace: syntetické oligo(A) standardy 30–150 nt

Hlavní výsledky a diskuse

Ze screeningu SEC kolon byla vybrána Protein SEC 250 Å pro optimální separaci 20–150 nt fragmentů. SEC‐UV metoda spolehlivě oddělila poly(A) ocas od krátkých oligonukleotidů a kalibrace vykázala lineární závislost logN vs. retence v rozsahu 30–150 nt. Šíře a fronting poly(A) píku odrážejí heterogenitu ocasu. Doplněné IP-RP LC umožnilo částečnou separaci jednotlivých N/x variant až do 150 nt a identifikovalo nejhojnější řetězec délky ~124 nt.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a robustní analýzu délky poly(A) ocasu
• Minimální přípravu vzorku bez nutnosti hmotnostní spektrometrie
• Jednoduchou implementaci v QC laboratořích farmaceutického průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s MS detekcí pro detailní charakterizaci heterogenity, optimalizace kolon pro vyšší rozlišení a automatizované high-throughput aplikace. Metodu lze adaptovat na sledování kvality mRNA v různých výrobních krocích.

Závěr

Navržená SEC-UV metoda je efektivní, přesná a snadno implementovatelná pro QC stanovení délky poly(A) ocasu mRNA. Je vhodným doplňkem k IP-RP LC postupům v rámci vývoje a výroby mRNA terapeutik.

Reference

1. M. Packer et al., Nat. Commun. 12, 6777 (2021).
2. T. Jiang et al., Anal. Chem. 91, 8500–8506 (2019).
3. M. Donegan et al., J. Chromatogr. A 1666, 462860 (2022).
4. A. Goyon et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 182, 113105 (2020).
5. V.B. Ivleva et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 2631–2640 (2010).
6. M. Gilar & U.D. Neue, J. Chromatogr. A 1169, 139–150 (2007).
7. M. Gilar et al., J. Chromatogr. A 958, 167–182 (2002).
8. G.J. Guimaraes et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 208, 114439 (2022).
9. J.M. Nguyen et al., Bioanalysis (2021).
10. M. Gilar et al., J. Chromatogr. A 1650, 462247 (2021).
11. M. DeLano et al., Anal. Chem. 93, 5773–5781 (2021).