Characterization of in vitro-transcribed (IVT) mRNA poly(A) tail by LC-HRAM-MS and BioPharma Finder 5.0 software

Význam tématu

Charakterizace poly(A) ocasu in vitro transkribovaných (IVT) mRNA molekul je zásadní pro hodnocení jejich stability, transportu z jádra a účinnosti translace. Délka a homogenita polyadenylace přímo ovlivňují terapeutický potenciál mRNA vakcín a léčiv, proto je přesná a spolehlivá analýza tohoto polímeru klíčová pro vývoj a kontrolu kvality biotechnologických produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou, robustní a vysoce přesnou LC-HRAM-MS metodiku doplněnou o software BioPharma Finder 5.0 pro identifikaci, sekvenční potvrzení a stanovení distribuce délek poly(A) ocasu v syntetizované IVT mRNA. Studie demonstruje workflow od přípravy vzorku až po dekonvoluovanou analýzu hmotnostních dat.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky IVT mRNA byly štěpeny RNázou T1, která selektivně štěpí v místě guanosinových zásad, zatímco poly(A) ocas zůstává intaktní. Oligonukleotidové fragmenty se purifikovaly na magnetických kuličkách Oligo(dT)25. Chromatografická separace probíhala IP-RP LC gradientem s modifikátory HFIP/DBA:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC
• Kolona: Thermo Scientific DNAPac RP (2,1 × 100 mm, 4 µm)
• Mobilní fáze: A – voda s 25 mM HFIP a 15 mM dibutylaminu; B – acetonitril s odpovídajícími modifikátory
• Teplota kolony: 70 °C, autosampler 5 °C

Detekce byla zajištěna v negativním módu na Orbitrap Exploris 240 MS (rozlišení 240 000, m/z 1 000–2 000), řízeném softwarem Chromeleon 7.3.1. Pro dekonvoluci používá BioPharma Finder 5.0 algoritmus Xtract, který z izotopicky rozlišených spekter extrahuje monoisotopické hmoty.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie ukázala ostrý jediný píkový profil poly(A) ocasu díky optimalizaci DBA jako iontového páru. MS spektrum obsahovalo multiply nabité ionty mezi z=20 a 40, dekonvoluce Xtractem přinesla přesnost 3–6 ppm. Vytvořením teoretického 140mer poly(A) řetězce v Sequence Manageru bylo možné jednotlivé monoisotopické hmoty očíslovat jako 3' truncace tomto vzorku. Dělením hmotností polymeru (330 Da) se získala distribuce délek poly(A), s průměrem kolem 125 adenosinových jednotek a úzkým rozptylem.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá alternativa k RNA-Seq pro stanovení délky poly(A) bez nutnosti amplifikace.
• Vysoká přesnost hmotnostních měření usnadňuje QC mRNA vakcín a terapeutik.
• Software BioPharma Finder umožňuje automatizovanou dekonvoluci a anotaci variací v polymerních sekvencích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky mohou být automatizace přípravy vzorků, rozšíření metody na analýzu dalších 3' modifikací mRNA, integrace s top-down proteomikou a zvýšení propustnosti díky paralelním UHPLC-MS systémům. Vylepšení softwaru pro masivní analýzu dat posílí možnosti sledování heterogenity produktů v reálném čase.

Závěr

Implementace LC-HRAM-MS na Orbitrap Exploris 240 v kombinaci s BioPharma Finder 5.0 představuje robustní a citlivou platformu pro detailní charakterizaci poly(A) ocasů in vitro transkribovaných mRNA. Metoda poskytuje přesné stanovení délky a distribuce adenosinových jednotek, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality mRNA vakcín a bioterapeutik.

Reference

• [1] Crick F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 1970;227(5258):561–563.
• [2] Millevoi S, Vagner S. Molecular Mechanisms of Eukaryotic Pre-mRNA 3' End Processing Regulation. Nucleic Acids Res. 2010;38(9):2757–2774.
• [3] Edmonds M, Abrams R. Polynucleotide Biosynthesis: Formation of a Sequence of Adenylate Units by Enzyme from Thymus Nuclei. J Biol Chem. 1960;235(4):1142–1149.
• [4] Edmonds M, Vaughan MH Jr, Nakazato H. Polyadenylic Acid Sequences in HeLa Cell RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1971;68(6):1336–1340.
• [5] Deo RC et al. Recognition of Polyadenylate RNA by Poly(A)-Binding Protein. Cell. 1999;98(6):835–845.
• [6] Natalizio BJ, Wente SR. Postage for the Messenger: Routes for Nuclear mRNA Export. Trends Cell Biol. 2013;23(8):365–373.
• [7] Weill L et al. Translational Control by Changes in Poly(A) Tail Length. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):577–585.
• [8] Gallie DR. Cap and Poly(A) Tail Synergy in Translational Efficiency. Genes Dev. 1991;5(11):2108–2116.
• [9] Goldstrohm AC, Wickens M. Multifunctional Deadenylase Complexes Diversify mRNA Control. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9(4):337–344.
• [10] Garneau NL et al. The Highways and Byways of mRNA Decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(2):113–126.
• [11] Park JE et al. Regulation of Poly(A) Tail and Translation during the Somatic Cell Cycle. Mol Cell. 2016;62(3):462–471.
• [12] Chang H et al. TAIL-Seq: Genome-Wide Determination of Poly(A) Tail Length. Mol Cell. 2014;53(6):1044–1052.
• [13] Roussis SG et al. Small Alkyl Amines as Ion-Pair Reagents for Oligonucleotide Separation. J Chromatogr A. 2019;1594:105–111.
• [14] Senko MW et al. Determination of Monoisotopic Masses from Resolved Isotopic Distributions. J Am Soc Mass Spectrom. 1995;6(4):229–233.