Determination of Protein Concentrations Using AAA-Direct

Význam tématu

Analýza aminokyselin (AAA) představuje zlatý standard pro kvantifikaci proteinů díky své schopnosti rozložit celý protein na jednotlivé aminokyseliny a jejich přímé měření. Metody barvivových testů (BCA, Lowry, Bradford) jsou rychlé a levné, ale trpí omezenou selektivitou a závislostí na specifických zbytcích v proteinech. AAA-Direct™, využívající aniontově-výměnnou chromatografii a integrovanou pulzní amperometrii (IPAD), umožňuje detekci aminokyselin bez nutnosti derivatizace, eliminuje toxické chemikálie a zjednodušuje postupy, což zvyšuje přesnost a bezpečnost analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje validaci metody AAA-Direct™ pro stanovení celkového obsahu proteinu v pěti neznámých roztocích (aprotinin, β-laktoglobulin, fetuin, hemoglobin, ubiquitin) dodaných Asociací biomolekulárních zdrojových laboratoří (ABRF). Cílem bylo porovnat přesnost, opakovatelnost a shodu s běžnými metodami AAA a barvivovými testy a ověřit možnosti detekce případných interferujících látek.

Použitá metodika

Analýza sestávala z následujících kroků:

• Hydrolýza: Sušené vzorky proteinů (300 µL, ~0,5 mg/mL) se hydrolyzovaly 16 h při 110 °C v uzavřených trubičkách s 6 M HCl pod argonem.
• Evaporace: Po ochlazení se HCl odpařila ve SpeedVacu a hydrolyzát se rekonstituoval vodou do objemu 300 µL; běžně se připravila i 10× zředěná série.
• Separace: Aniontově-výměnná kolona AminoPac PA10 (2×250 mm) s gradientem 250 mM NaOH a 1 M NaAc rozdělovala aminokyseliny za 30 °C a proudu 0,25 mL/min.
• Detekce: Integrovaná pulzní amperometrie (ED50) na zlaté elektrodě v pH módu umožnila přímou detekci bez derivatizace.
• Kvantifikace: Kalibrace na standardní směs 17 aminokyselin (NIST SRM 2389) a tři poziční standardy 2,5–25 µM. Výsledná plocha píků vzorků minus blank se přepočítala lineární regresí na koncentrace aminokyselin a součet dal celkový obsah proteinu.

Použitá instrumentace

• Dionex BioLC systém s gradientním pumpou GP50 (PEEK, mikroobjem, odplynování).
• Autosampler AS50 s termokomorou (25 µL obje-mová smyčka).
• Elektrochemický detektor ED50 s jednorázovou zlatou elektrodou a kombinovanou pH/Ag/AgCl referencí.
• Kolony AminoPac PA10 analytická (2×250 mm) a ochranná (2×50 mm).
• SpeedVac Evaporator (SVC100) s chlazeným parním kondenzátorem a vakuovou pumpou.
• Reacti-Therm™ III s blockem H pro kontrolu hydrolýzyžehlení.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda AAA-Direct prokázala:

• Kvantifikaci BSA s průměrným výsledkem 66,8 mg/mL (93,3 % z deklarovaných 71,6 mg/mL), s RSD 2,7 % (3 separátní dny).
• Srovnatelnou přesnost u ostatních proteinů: aprotinin (1,70 mg/mL, RSD 1,3 %), β-laktoglobulin (1,63 mg/mL, RSD 6,4 %), fetuin (1,22 mg/mL, RSD 4,5 %), hemoglobin (1,55 mg/mL, RSD 18 %), ubiquitin (1,84 mg/mL, RSD 5 %).
• Shodu s výsledky 26 laboratoří ABRF: průměrné RSD 11–16 % pro ne-AAA-Direct metody, AAA-Direct RSD 1–18 %.
• Detekci glykozylace ve fetuinu podle výskytu galaktosaminu a glukosaminu.
• Omezení degradací: Trp a cystin vyžadují speciální hydrolýzu; dehydratace Asn/Gln je kompenzována jako Asp/Glut.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace derivatizace: nižší spotřeba činidel, nižší riziko expozice a méně odpadu.
• Široká selektivita: přímé oddělení 20 běžných a netypických aminokyselin i aminocukrů.
• Vysoká citlivost a opakovatelnost (RSD < 7 % u většiny proteinů).
• Možnost rozlišení interferencí z matrice (Tris, sacharidy).
• Aplikace v QA/QC, farmaceutickém vývoji, proteomice a biotechnologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace hydrolýzy pro zachování citlivých zbytků (oxidativní hydrolýza, enzymatická varianta).
• Rozvoj plně automatizovaných pracovních postupů a miniaturizace pro vysokopropustné analýzy.
• Rozšíření o stanovení posttranslačních modifikací (fosforylace, karboxylace).
• Integrace s HRMS pro identifikaci a sekvenční analýzu méně zastoupených zbytků.
• Pokročilá datová zpracování pro predikci čistoty a kontroly stability proteinů.

Závěr

AAA-Direct™ představuje účinnou a přímočarou metodu pro přesné stanovení celkového obsahu proteinu bez derivatizace. Kombinace aniontově-výměnné chromatografie a amperometrické detekce umožňuje vysokou citlivost, nižší náklady na činidla a ekologičtější provoz. Výsledky se shodují s konvenčními AAA i barvivovými testy a prokazují robustnost metody i při analýze glykoproteinů.

Reference

• Smith P.K. et al. Anal. Biochem. 1985, 150, 76–85.
• Wiechelman K. et al. Anal. Biochem. 1988, 175, 231–237.
• Lowry O.H. et al. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265–275.
• Legler G. et al. Anal. Biochem. 1985, 150, 278–287.
• Bradford M.M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254.
• Tal M. et al. J. Biol. Chem. 1980, 260, 9976–9980.
• Compton S.J.; Jones C.J. Anal. Biochem. 1985, 151, 369–374.
• Schegg K.M. et al. Techniques in Protein Chemistry VIII, Academic Press 1997, 207–216.
• Alterman M. et al. ABRF 2003 Amino Acid Analysis Study, poster 2003.
• Dionex Corp. AAA-Direct Product Manual, 2016.
• Dionex Corp. Technical Note 53: Glycoprotein Monosaccharide Analysis.
• Dionex Corp. Technical Note 55: Screening Matrices for AAA-Direct.
• Dionex Corp. App. Note 142: Tryptophan Analysis by AAA-Direct.
• Davidson I. Methods Mol. Biol. 2003, 120: Hydrolysis for AAA.
• Dionex Corp. App. Note 150: Amino Acids in Culture Media.
• Hanko V.P.; Rohrer J.S. Anal. Biochem. 2003, 324, 29–38.
• Hanko V.P.; Rohrer J.S. Anal. Biochem. 2002, 308, 204–209.
• Hanko V.P.; Rohrer J.S. Gen. Eng. News 2003, 23(3), 38.
• Jandik P. et al. Methods Mol. Biol. 2000, 159, 159–168.
• Piez K.A. in Biochemistry of Collagen, Plenum Press 1976.
• Hay E.D. Cell Biology of Extracellular Matrix, Plenum 1981.
• Hardie D.G. Protein Phosphorylation: A Practical Approach, Oxford 1999.
• Dionex Corp. Technical Note 40: HPAE-PAD Monosaccharide Analysis.
• Dionex Corp. Technical Note 50: Peptide AAA-Direct Hydrolysis.