Determination of Tryptophan Using AAA-Direct

Význam tématu

Určení tryptofanu (Trp) je klíčové pro kvantifikaci bílkovin, peptidů a monitorování buněčných kultur. Trp je při běžné kyselé hydrolýze náchylný k degradaci, a proto jsou vyvíjeny postupy pro jeho zachování a přesné stanovení. AAA-Direct umožňuje rychlou, citlivou analýzu Trp s minimální přípravou vzorku a bez derivatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout izokratickou metodu AAA-Direct pro rychlé oddělení a přímou detekci Trp pomocí aniontové výměnné chromatografie (AminoPac PA10) a integrované pulzní amperometrie (IPAD). Dvě varianty metody (Method 1 a Method 2) optimalizují dobu běhu a citlivost, přičemž obě umožňují uniknout rušivým koelonujícím složkám.

Použitá metodika a instrumentace

Hydrolýza:

• 4 M NaOH, 110 °C, inertní plyn (argon nebo dusík) v hlavním prostoru
• Vzorky: volný Trp, peptid LH-RH, BSA, fermentační močovina

Chromatografie AAA-Direct:

• AminoPac PA10 Analytical + Guard kolony (2 × 250 a 2 × 50 mm)
• Dionex BioLC systém: GP50 pumpa, EO1 organizér eluční složky, AS50 autosampler, ED50 detektor s AAA-Certified Gold Cell
• Eluenty: 250 mM NaOH, 1 M NaOAc, kombinace 1 M NaOAc/50 mM NaOH
• Detekce: integrovaná pulzní amperometrie, standardní pH–Ag/AgCl referenční elektroda

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody vykázaly lineární odezvu až do 100–200 µM (Metoda 1) a 200–500 µM (Metoda 2). Lower Limit of Detection (LOD) ~0,12–0,14 µM (1,2–1,4 pmol/inj.), LOQ ~0,41–0,46 µM. Reprodukovatelnost 2,4 % RSD (144 injekcí, 80 h) u Metody 1. Rychlosti běhu: 18,3 min (Metoda 1), 9,5 min (Metoda 2).
Hydrolýza v přítomnosti inertního plynu (argon) zvýšila maximální zisk Trp z BSA na ~120 % (2 h), poté degradace stoupala. U peptidu LH-RH byla maximální rec. ~45  % (90 min) z důvodu nižší koncentrace ochraňujících aminokyselin.
V komplexních matricích (glukóza, YPD výživa, E. coli kulturální supernatant) byla obnova 99 –110 % a nebyly zjištěny rušivé koelonizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení práce spojené s derivatizací Trp
• Minimalizace přípravy vzorku – přímé injekce
• Rychlý monitoring fermentací a buněčných kultur
• Pozorování uvolnění a spotřeby Trp v reálném čase pro optimalizaci výrobních procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

Vyšší automatizace hydrolýzy ve vakuu s plastovými trubicemi odolnými vůči alkalii. Kombinace s kvantitativními hmotnostními metodami pro potvrzení produktů degradace Trp. Rozšíření pro simultánní stanovení derivátů Trp v bioprocesních odběrech a biofarmaceutických přípravcích.

Závěr

Izokratické metody AAA-Direct nabízejí rychlou, spolehlivou a vysoce citlivou analýzu tryptofanu v různých typech vzorků. Díky přímé detekci IPAD a optimalizovaným elučním podmínkám je možné provádět vysoce propustné analýzy bez náročné chemické úpravy.

Reference

1. Matsubara H., Sasaki R.M. High Recovery of Tryptophan from Acid Hydrolysates of Proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969;35:175–181.
2. Bozzini M.L., Bello R., Cagle N., Yamane D., Dupont D. Tryptophan Recovery from Autohydrolyzed Samples Using Dodecanethiol. Appl. Biosci. Res. News 1991.
3. Moore S., Stein W.H. Chromatographic Determination of Amino Acids by the Use of Automatic Recording Equipment. Methods Enzymol. 1963;6:819–831.
4. Hugli T.E., Moore S. Determination of the Tryptophan Content of Proteins by Ion Exchange Chromatography of Alkaline Hydrolysates. J. Biol. Chem. 1972;247:2828–2834.
5. Simpson R.J., Neuberger M.R., Liu T.-Y. Complete Amino Acid Analysis of Proteins from a Single Hydrolysate. J. Biol. Chem. 1976;251:1936–1940.
6. Clarke A.P., Jandik P., Rocklin R.D., Liu Y., Avdalovic N. An Integrated Amperometry Waveform for Direct, Sensitive Detection of Amino Acids and Amino Sugars Following Anion-Exchange Chromatography. Anal. Chem. 1999;71:2774–2781.
7. Jandik P., Clarke A.P., Avdalovic N., Andersen D.C., Cacia J. Analyzing Mixtures of Amino Acids and Carbohydrates Using Bi-Modal Integrated Amperometric Detection. J. Chromatogr. B 1999;732:193–201.
8. Dionex Corporation. Installation Instructions and Troubleshooting Guide for the AAA-Direct Amino Acid Analysis System. Doc. No. 031481, Rev. 03, 2000.
9. Hirayama K., Akashi S., Furuya M., Fukuhara K. Rapid Confirmation and Revision of the Primary Structure of Bovine Serum Albumin by ESIMS and Frit-FAB LC/MS. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990;173:639–646.