Identification of a Hydroxylysine-Containing Peptide Using AAA-Direct

Význam tématu

Peptidová mikroheterogenita způsobená posttranslačními modifikacemi, jako je hydroxylysin vzniklý hydroxylací lysinu, hraje klíčovou roli ve funkci extracelulárních proteinů včetně kolagenu a ovlivňuje vlastnosti biologických léčiv. Přesná identifikace a kvantifikace takových změn je nezbytná pro procesní vývoj, kontrolu kvality a zajištění bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikacního sdělení bylo demonstrovat, že systém AAA-Direct™ je vhodný k detekci peptidů obsahujících hydroxylysin a ke srovnání čistoty dvou syntetických CD4 fragmentů odlišných jedinou posttranslační modifikací. Studie zahrnovala hydrolytickou přípravu vzorků, komparaci výsledků AAA-Direct s RP-HPLC a kationtovou chromatografií a ověření metod pro odstranění soli z peptidových frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky peptidů byly hydrolyzovány v 6 M HCl a analyzovány přímou injekcí (AAA-Direct™) s pulzní amperometrií detekce (ED50). Pro separaci nehydrolyzovaných frakcí peptidů byly využity:

• Reverzní fáze RP-HPLC (Acclaim C18, 4,6×250 mm) s UV detekcí při 220 nm
• Kationtová výměnná chromatografie (ProPac WCX-10, 4×250 mm) s UV detekcí při 210 nm
• Aniontová výměnná chromatografie (IonPac AS14A, 3×150 mm) s konduktometrickou detekcí po potlačeném elučním proudu

Pro přípravu a desalinaci vzorků byly použity:

• SpeedVac odparovací systém pro koncentrování vzorků
• Biodialyser™ mikro­dialýza s MWCO 100 a 500 daltonů pro odstranění chloridů a fosfátů

Hlavní výsledky a diskuse

1. Separace aminokyselin pomocí AAA-Direct na kolonu AminoPac PA-10 rozlišila hydroxylysin od ostatních běžných aminokyselin.
2. Kompozice Lys-peptidu odpovídala teoretickému poměru aminokyselin. RP-HPLC i kationtová chromatografie prokázaly vysokou čistotu.
3. Hyl-peptid obsahoval nečekané nečistoty: RP-HPLC ukázala devět špiček, kationtová W CX-10 chromatografie dvanáct, přičemž dvě frakce odpovídaly výhradně požadovanému Hyl-peptidu (obsah 1 mol Hyl a 1 mol Lys).
4. Vysoký obsah solí v peptidových hydrolysátech posunoval retenční časy a komplikoval interpretaci.
5. Mikro­dialýza s 500 daltonovým MWCO dosáhla ~87 % odstranění NaCl a ~47 % odstranění fosfátu, bez interferencí v AAA-Direct chromatogramech.

Přínosy a praktické využití metody

AAA-Direct umožňuje rychlou, citlivou a kvantitativní analýzu posttranslačních modifikací připravených peptidů a proteinů. Kombinace s chromatografickými metodami pro separaci nehydrolyzovaných vzorků poskytuje komplexní přístup k identifikaci a kvantifikaci mikroheterogenity. Desalinační kroky zajišťují spolehlivost výsledků a validitu retencí při vysokém obsahu solí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje zahrnují:

• Integraci AAA-Direct s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci sekvenčních izomerů
• Automatizované desalinační moduly a online dialýzu pro zvýšení reproducibility
• Vývoj kolony pro selektivnější rozlišení epimerů D/L hydroxylysinu
• Aplikaci metody v průmyslové výrobě bioterapeutik jako standardní součást QC

Závěr

Studie ukázala, že systém AAA-Direct v kombinaci s kationtovou a reverzní chromatografií dokáže spolehlivě identifikovat a kvantifikovat hydroxylysine-obsahující peptidy a odhalit nečistoty v syntetických fragmentech. Mikro­dialýza se osvědčila jako efektivní metoda pro odstranění solí a zajištění přesnosti analýzy.

Reference

1. Kivirikko K I, Myllyla R, Pihlajaniemi T. Posttranslational Modifications of Proteins; CRC Press; 1992.
2. Molony M S, Quan C, Mulkerrin M G, Harris R J. Anal Biochem. 1998;258:136–137.
3. Molony M S, Wu S L, Keyt L K, Harris R J. Techniques in Protein Chemistry VI; Academic Press; 1995:91–98.
4. Dionex Corp. AAA-Direct Amino Acid Analysis Installation and Troubleshooting Guide; 2003.
5. Dionex Corp. Technical Note 50 Determination of Amino Acid Content by AAA-Direct; 2003.
6. Snyder L R, Kirkland J J, Glajch J L. Practical HPLC Method Development, 2nd ed.; Wiley; 1997.