Determination of Nucleotides by Ion Chromatography with UV Absorbance Detection

Význam tématu

Odhad a kvantifikace nukleotidů v PCR směsích je klíčová pro kontrolu kvality reakčních komponent a zajištění úspěšné amplifikace DNA či RNA. Nesprávné molární poměry nebo přítomnost degradovaných monofosfátů či difosfátů může vést k selhání PCR, což má dopad v diagnostice, forenzní analýze i výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a validovat jednoduchou a přímou metodu stanovení mono-, di- a trifosfátů deoxynukleosidů a nukleosidů v PCR a podobných polymerázových reakcích. Metoda využívá aniontovou výměnnou chromatografii na sloupci DNAPac PA100 s gradientní elucí a detekcí UV absorbance při 260 nm. Studie hodnotila linearitu, citlivost, selektivitu, robustnost a schopnost odhalit kontaminanty a degradované produkty.

Použitá instrumentace

• Dionex BioLC systém: čerpadlo GP50, detektor AD25, autosampler AS50 s chlazením
• Software Chromeleon 6
• Analytický sloupec DNAPac PA100 (4×250 mm)
• Termocyklér Progene FPR0G05Y

Použitá metodika

• Eluce gradientním programem s eluenty na bázi NaOH, Na3PO4 a NaClO4
• Počáteční složení eluční směsi: 79 % vody, 17 % 34 mM Na3PO4/100 mM NaOH, 4 % 100 mM NaClO4
• Gradientní přechod k vyšší koncentraci NaClO4 pro separaci aniontů
• Teplota sloupce 20 °C, průtok 1,5 mL/min, objem injekce 10 µL
• Detekce UV absorbance při 260 nm
• Příprava standardů v 10 mM Tris/1 mM EDTA, filtrace vzorků 0,2 µm

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineárnost pro rozsah 0,1–150 µmol/L (r2 ≥ 0,995) pro všechny analyty
• Detekční limity 0,012–0,051 µmol/L při S/N ≥ 5
• Možnost úpravy selektivity změnou pH elučního pufru a teploty sloupce
• Spolehlivá detekce degradovaných mono- a difosfátů v tepelně upravených vzorcích
• Ruggednost: retence analytů stabilní do 5 % RSD při provozu různými operátory
• Analýza PCR směsí odhalila chybějící dGTP jako příčinu neúplné amplifikace

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a citlivou kontrolu kvality dNTP směsí a včasnou identifikaci degradovaných produktů či kontaminantů. Uplatnění nalézá v diagnostických laboratořích, forenzní analýze, QA/QC a výzkumných projektech, kde je spolehlivost PCR klíčová.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a elučních pufrů
• Integrace s hmotnostní spektrometrií nebo fluorescenční detekcí
• Přechod na UHPLC pro zkrácení doby analýzy
• Rozšíření stanovení na komplexní biologické matrixy
• Monitorování polymerázové aktivity in situ

Závěr

Validovaná metoda poskytuje rychlou, citlivou a robustní analýzu nukleotidů a jejich degradačních forem v PCR směsích. Zajišťuje spolehlivou kontrolu kvality reagentů a možnost identifikace příčin selhání polymerázových reakcí.

Reference

1. Patent PCR procesu vlastněný společností Hoffman-LaRoche, Inc.
2. ASTM D 1193 Standardní specifikace pro reagenční vodu