Analysis of mRNA Poly-A Sequence Variants by High-Resolution LC/MS

Význam tématu

Analýza délky a složení poly-A posloupností je klíčová pro kontrolu kvality mRNA vakcín a terapií, neboť variace v polyadenylaci ovlivňují stabilitu a biologickou aktivitu mRNA. Detailní charakterizace produktových impurit, zejména sekvenčních variant vzniklých neúplnou selektivitou Poly-A polymerázy (PAP), je nezbytná pro splnění regulačních požadavků a optimalizaci výrobních procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo využít vysokorozlišovací LC/Q-TOF hmotnostní spektrometrii k analýze poly-A ocasů syntetických RNA primerů i plné délky in vitro transkribované mRNA. Hlavními úkoly bylo (1) stanovit distribuci délek poly-A řetězců a (2) zjistit míru a charakter sekvenčních variant vzniklých při použití různých nukleosidtrifosfátů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly aplikovány tyto kroky:

• In vitro transkripce mRNA plasmidové šablony pomocí kitu HiScribe T7 ARCA.
• Příprava poly-A ocasů u PAP v přítomnosti jednotlivých NTP (ATP, CTP, UTP, GTP) i jejich směsi.
• Enzymatická fragmentace RNase T1 a obohacení poly-A segmentů oligo-dT magnetickými perličkami.
• Kapalinová chromatografie na Agilent 1290 Infinity II LC/DAD s kolonkami Poroshell 120 HPH-C18 a PLRP-S.
• Detekce na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v negativním módu a bioinformatická dekonvoluce v MassHunter BioConfirm.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza syntetických primerů odhalila dvouvrstvou eluci: krátké oligonukleotidy (11–22 nt) a dlouhé (108–149 nt). Dekonvoluce umožnila precizní určení jednotlivých řetězců s rozdíly <1,2 Da oproti teorii. V přítomnosti jen jednoho typu NTP docházelo k nečekanému přidání C a U nukleotidů, potvrzenému MS/MS diagnostickými y-ionty. U plné délky mRNA byl rovněž zjištěn heterogenní profil ocasů (16–27 nt) v krátké populaci, včetně jednotkových chyb v sekvenci.

Přínosy a praktické využití metody

Vysokorozlišovací LC/MS poskytuje citlivou a selektivní alternativu k radioaktivním či sekvenačním postupům (RNA-seq). Umožňuje rychlé kvantitativní vyhodnocení délky i složení poly-A ocasů bez artefaktů z amplifikačních kroků, což je zásadní pro vývoj a kontrolu mRNA léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení lze očekávat v oblasti rychlejších separačních technik, automatizované datové analýzy a detekce stopových sekvenčních variant v dlouhých řetězcích. Integrace LC/MS do rutinních QC workflow umožní vyšší spolehlivost mRNA produktů a zrychlení vývoje nových genových terapií.

Závěr

Studie prokázala schopnost Agilent AdvanceBio LC/Q-TOF přesně měřit heterogenní poly-A řetězce a odhalit neúplnou selektivitu PAP pro ATP. Tyto poznatky přispívají k lepší kontrole kvality mRNA vakcín a terapií a podpoří optimalizaci výrobních procesů.

Reference

1. Jackson L. A. et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. 2020.
2. Mulligan M. J. et al. Phase I/II Study of COVID-19 RNA Vaccine BNT162b1. Nature 2020.
3. Pfizer and BioNTech. Vaccine Candidate Interim Analysis.
4. NIH-Moderna COVID-19 Vaccine Clinical Results.
5. Wadhwa A. et al. Delivery of mRNA-Based Vaccines. Pharmaceutics 2020.
6. Kahvejian A. et al. Mammalian Poly(A)-Binding Protein. Genes Dev. 2005.
7. Beverly M., Hagen C., Slack O. Poly A Tail Length Analysis by LC/MS. Anal. Bioanal. Chem. 2018.
8. Birdsall R. E. et al. Reduction of Metal Adducts in Oligonucleotide MS. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2016.
9. Tateishi-Karimata H. et al. Transcription Fidelity and Structure. PLOS ONE 2014.
10. Yehudai-Resheff S., Schuster G. Characterization of E. coli Poly(A) Polymerase. Nucleic Acids Res. 2000.