Identification of Oxidation Sites on a Monoclonal Antibody Using an Agilent 1260 Infinity HPLC-Chip/MS System Coupled to an Accurate-Mass 6520 Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky mohou během výroby, purifikace či skladování podléhat oxidaci, která ovlivňuje jejich biologickou aktivitu a stabilitu. Systematická identifikace míst oxidace je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie demonstruje využití systému Agilent 1260 Infinity HPLC-Chip/MS ve spojení s Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS a softwarem MassHunter BioConfirm k lokalizaci oxidativních modifikací na monoklonální protilátce oxidované peroxidem vodíku.

Použitá metodika a instrumentace

• Oxidace vzorku: Inkubace protilátky (1 mg/mL) s 50 % H2O2 po dobu 20 minut při pokojové teplotě.
• Redukce a alkylace: Denaturace v 8 M ureě, redukce DTT, alkylace iodoacetamidem ve tmě.
• Proteolýza: Trypsinová digesce při 37 °C přes noc, zastavení kyselinou.
• Chromatografie: HPLC-Chip s 40 nL napouštěcí kolonkou a 75×43 mm analytickou C18 kolonkou, gradient 3–50 % acetonitrilu (0,1 % FA).
• HM-spektrometrie: ESI nanospray, Vcap 1 900 V, suchý plyn 5 L/min (325 °C), fragmentor 175 V, rozsahy MS 300–3 200 m/z a MS/MS 50–3 000 m/z, interní kontinuální kalibrace.
• Software: MassHunter Qualitative Analysis s Molecular Feature Extractor a BioConfirm pro teoretickou digesci, vyhledání a mapování oxidativních modifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní protilátka vykázala molekulovou hmotnost 148 811,90 Da, odpovídající glykozylované formě (teoretická 148 811,95 Da).
• Po oxidaci H2O2 byla průměrná adice 9 kyslíků (přírůstek ~9×15,9949 Da) pozorována na intaktním proteinu.
• Celkový iontový chromatogram digesce odhalil úzké vrcholy peptidů s přidanými modifikacemi.
• Peptidy obsahující methionin a tryptofan vykázaly preferenční oxidaci (+16/32 Da). Příklad peptidu NTLYLQMSSLR ukázal v MS/MS nárůst ~16 Da na y5–y9 fragmentech, modifikace lokalizována na residuu Met.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou, vysoce citlivou a prostorově specifickou identifikaci oxidativních míst na monoklonálních protilátkách. Užitečná je pro QA/QC procesy, validaci stability a vývoj biopharmaceutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace mikrofluidických modulů pro plnou automatizaci vzorkové přípravy.
• Zvýšení propustnosti analýz díky paralelizaci čipových formátů.
• Pokročilé softwarové nástroje pro multi-omics studie a prediktivní modelování oxidačních drah.

Závěr

Spojení HPLC-Chip/MS a vysokorezolučního Q-TOF LC/MS s pokročilým softwarem MassHunter BioConfirm poskytuje komplexní platformu pro detailní mapování oxidativních modifikací na monoklonálních protilátkách, přispívá k zabezpečení kvality biopharmaceutik a podporuje další rozvoj analytických metod.

Reference

• Gudihal R. et al., Primary Characterization of a Monoclonal Antibody Using Agilent HPLC-Chip Accurate-Mass LC/MS Technology, Agilent Application Note, 2008, 5990-3445EN.
• Gudihal R., Waddell K., Peptide mapping of a monoclonal antibody using a microfluidic-based HPLC-Chip coupled to an Agilent Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, Agilent Application Note, 2009, 5990-4587EN.
• Huang L. et al., In Vivo Deamidation Characterization of Monoclonal Antibody by LC/MS/MS, Anal. Chem., 2005, 77(5):1432-1439.
• Dick L. et al., Peptide mapping of therapeutic monoclonal antibodies: Improvements for increased speed and fewer artifacts, Journal of Chromatography B, 2009, 877:230-236.