Fast and Robust LC-UV-MS Based Peptide Mapping Using RapiZyme™ Trypsin and IonHance™ DFA

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová metoda v proteomice a biofarmaceutické charakterizaci pro přesnou identifikaci proteinů a analýzu jejich primární struktury. Rychlé a robustní workflow urychluje vývoj a kontrolu jakosti bioterapeutik, minimalizuje vznik artefaktů a zkracuje dobu přípravy vzorku.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí kombinaci nové RapiZyme™ Trypsin trávení s vysokým poměrem enzym:protein (1:5) a krátkou dobou inkubace (1 h) spolu s mobilní fází obsahující IonHance™ DFA pro LC-UV-MS peptidové mapování. Cílem bylo dosáhnout 100% pokrytí sekvence pro modelový NISTmAb, zajistit adukt-volné spektrometry a zlepšit UV citlivost při zachování reprodukovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byl NISTmAb ošetřen denaturací, redukcí, alkylací a desaltem pomocí SEC kolonek. Následovalo trávení RapiZyme™ Trypsinem při 37 °C 1 h, quenche acidifikací. LC separace probíhala na systému ACQUITY UPLC I-Class PLUS s detekcí UV/PDA (219 nm) a kolonkou Peptide CSH C18 (2,1×150 mm, 1,7 µm). Jako aditivum mobilní fáze byla použita IonHance™ DFA (0,1 % ve vodě/0,07 % v acetonitrilu). MS analýza pak na ACQUITY RDa ve fragmentačním režimu MSe a pozitivní polaritě. Systémy UNIFI 3.0 a Empower 3 sloužily pro řízení přístrojů a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Protokol dosáhl 100% pokrytí aminokyselin pro těžký i lehký řetězec NISTmAb během pouhých 3 h přípravy vzorku. IonHance DFA zajistila adukt-volná MS spektra i při vysoké intenzitě produktových iontů, a zároveň zvýšenou UV citlivost bez významného posunu retencí. Reprodukovatelnost byla potvrzena stabilními UV a BPI chromatogramy tří nezávislých replikátů. Srovnání s klasickým formátovým workflow ukázalo významné zkrácení doby přípravy a lepší detekci nízkoabundantních peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení trávení na 1 h díky vysoké aktivitě RapiZyme™ Trypsin.
• Pod 3 h celková doba přípravy vzorku, ideální pro QC laboratoře.
• IonHance DFA zlepšuje UV citlivost a reprodukovatelnost retencí bez aduktů.
• Možnost provádět následné UV-only běhy pro rutinní kontrolu po počáteční LC-UV-MS kalibraci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření platformních metod pro automatizovanou high-throughput QC analýzu bioterapeutik. Další optimalizace aditiv mobilní fáze a enzymových procesů může vést k ještě rychlejšímu a citlivějšímu workflow. Integrace umělé inteligence pro automatickou identifikaci peptidů posílí robustnost výsledků.

Závěr

Kombinace RapiZyme™ Trypsin a IonHance™ DFA nabízí rychlé, reprodukovatelné a citlivé peptidové mapování s adukt-volnými spektremi a zkrácenou přípravou vzorku. Metoda je připravena pro rutinní nasazení v prostředí biotechnologických a farmaceutických laboratoří.

Reference

1. Nguyen JM, Smith J, Rzewuski S, Legido-Quigley C, Lauber MA. High Sensitivity LC-MS Profiling of Antibody-Drug Conjugates With Difluoroacetic Acid Ion Pairing. mAbs. 2019;11(8):1358–1366.
2. Gross ML, Chen G, Pramanik BN. Protein and Peptide Mass Spectrometry in Drug Discovery. 2012.
3. Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS Peptide Mapping Protocol for the NISTmAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410(8):2111–2126.