Comparing Mobile Phase Additives for the Separation of mAb Tryptic Peptides: A Case Study on Formic, Difluoroacetic, and Trifluoroacetic Acid

Porovnání mobilních fází pro separaci tryptických peptidů mAb

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová metoda pro kontrolu primární struktury bioléčiv a identifikaci posttranslačních modifikací.
Optimalizace složení mobilních fází zásadně ovlivňuje chromatografické rozlišení a citlivost LC-MS analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí tři iontově párovací kyseliny – formiovou (FA), trifluroctovou (TFA) a difluoroctovou (DFA, IonHance DFA) – při separaci tryptických peptidů z NIST mAb standardu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek sestával z tryptického digestu NIST mAb (Waters mAb Tryptic Digest Standard) rekonstituovaného ve 0,1 % kyselině formiové.
Chromatografie probíhala na UPLC H-Class PLUS Bio System při 80 °C za použití kolonek ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 a CSH C18.

Použitá instrumentace

• UPLC H-Class PLUS Bio System (Waters)
• Kolonky: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, Peptide CSH C18
• Iontově párovací činidla: 0,1 % FA, 0,1 % TFA, 0,1 % IonHance DFA
• Hmotnostní spektrometr Xevo G2-XS QToF, software MassLynx v4.1 a UNIFI v1.8

Hlavní výsledky a diskuse

• Selectivita: DFA vykazuje retenci a selektivitu mezi FA a TFA, čímž nabízí odlišné rozdělení peptidů.
• MS citlivost: Citlivost s DFA je vyšší než u TFA, nepatrně nižší než u FA.
• Rozlišení: TFA poskytuje nejvyšší efektivní kapacitu, DFA se blíží hodnotám TFA a výrazně převyšuje FA.
• Addukty: IonHance DFA s nízkým obsahem kovů potlačuje tvorbu sodiových aduktů a zajišťuje čistší spektra.

Přínosy a praktické využití metody

• IonHance DFA nabízí vyvážený kompromis mezi chromatografickým rozlišením a MS citlivostí.
• Zajišťuje kvalitní spektra bez výrazných aduktů vhodná pro kvantifikaci a modifikační studie.
• Umožňuje flexibilní vývoj peptidových map podle analytických požadavků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší nasazení DFA pro různé proteiny a peptidy.
• Optimalizace gradientních programů a pH mobilních fází pro kritické peptidové separace.
• Integrace metody do rutinní kontroly kvality bioléčiv v průmyslové analytice.

Závěr

IonHance DFA představuje efektivní alternativu k FA a TFA v peptidovém mapování, spojuje vysoké chromatografické rozlišení s dobrou MS citlivostí a nízkou hladinou kovových aduktů.

Reference

1. Monroe ME. The University of North Carolina at Chapel Hill; 2002.
2. Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, et al. Tools to Improve Protein Separations. LCGC North America. 2015;33:856–865.
3. Nguyen JM, Smith J, Rzewuski S, Legido-Quigley C, Lauber MA. High sensitivity LC-MS profiling of antibody-drug conjugates with difluoroacetic acid ion pairing. mAbs. 2019;11(7):1–9.
4. De Cecco M, Espeso MS, Nguyen JM, Lauber MA. LC-MS profiling of IgG2 isoforms using difluoroacetic acid and reversed-phase chromatography. Waters Tech Brief, 720006473EN (2019).
5. Kellett J, Birdsall R, Yu Y. Application of difluoroacetic acid to improve optical and MS performance in peptide LC-UV/MS. Waters Tech Brief, 720006482EN (2018).
6. Nguyen JM, Liu X, Lauber MA. Low adduct peptide LC-MS obtained with IonHance DFA and certified LDPE containers. Waters App Note, 720006596EN (2019).
7. Lauber MA, Koza SM, McCall SA, et al. High-resolution peptide mapping separations with MS-friendly mobile phases and charge-surface-modified C18. Anal Chem. 2013;85(6):6936–6944.
8. Koza SM, Chambers EE. Selecting a reversed-phase column for the peptide mapping analysis of a biotherapeutic protein. Waters App Note, 720005924EN (2017).