Automated High-Throughput LC-MS Focused Peptide Mapping of Monoclonal Antibodies in Microbioreactor Samples

Význam tématu

Automatizace a zrychlení analýzy kvality monoklonálních protilátek (mAb) z mikrobioreaktorových vzorků je klíčové pro efektivní vývoj a optimalizaci bioprocesu. Nízké objemy a koncentrace vzorků kladou vysoké nároky na metoda přípravy a detekce kritických kvalitativních atributů (CQA), jako jsou glykozylace, deamidace a oxidace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout plně automatizovaný proces pro přípravu a rychlou LC-MS peptidovou mapu mAb s nízkým odběrem (30 µL, 30 µg proteinů) při nízké koncentraci (1 mg/mL). Metoda kombinuje automatizované vyvážení pufru, redukci, trypsinovou digesci a rychlou chromatografii s ESI-ToF detekcí pro stanovení CQA peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků:

• Automatická platforma Andrew+ (Andrew Alliance) s modulárními dominy Extraction+ a Pipetting+
• Filtrační destička 10 kDa MWCO pro vyvážení pufru
• Denaturačně-redukční pufr: 6 M guanidin-HCl, DTT, methionin, Tris pH 7,5
• Trypsin RapiZyme™ (vysoká odolnost proti autolýze) v pufru s metioninem a Tris pH 7,5

Analytické stanovení:

• UPLC systém ACQUITY I-Class PLUS s kolonkou ACQUITY Premier CSH C18 (1,7 µm, 2,1 × 100 mm) při 60 °C
• BioAccord LC-MS s ESI-ToF detektorem (50–2000 m/z, 5 Hz, kladná ionizace)
• Rychlá gradientní eluce (6 min) pro vysokoproužkovou analýzu
• Software waters_connect s aplikací Peptide MAM pro automatizovanou kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol dokázal připravit 48 vzorků za 3,5 hodiny, včetně 2 hodinové digesce. Desetiminutové LC-MS běhy umožňují vysokou propustnost. Při objemu injekce 10 µL (2 µg proteinů) byla dosažena reprodukovatelnost %RSD < 20 % u všech 20 zkoumaných CQA peptidů (n = 10). Rychlý 6 min gradient poskytl dostatečnou rozlišovací schopnost pro relativní kvantifikaci, i když s mírně nižším chromatografickým rozlišením než 50 min gradient. Metoda spolehlivě detekovala rozdíly mezi nestresovanými, stresovanými a 1:1 směsnými vzorky, zejména u oxidace a deamidace specifických pozic.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální nutný objem vzorku (30 µL) a nízká koncentrace (1 mg/mL)
• Plná automatizace s omezenou manuální intervencí
• Vysoká propustnost: až 48 vzorků za den
• Spolehlivá kvantifikace klíčových modifikací pro výběr buněčných klonů a optimalizaci bioprocesu
• Flexibilita pro jiné proteinové vzorky

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace automatizovaných platforem s pokročilou bioinformatikou a strojovým učením pro rychlejší vyhodnocení výsledků. Miniaturizace, nové enzymy s vyšší aktivitou a odolností, stejně jako rozšíření na plnohodnotné MAM workflows pro komplexní sledování více atributů budou v další fázi rozvoje.

Závěr

Vyvinutá metoda kombinuje automatizovanou přípravu vzorků a rychlou LC-MS analýzu pro efektivní a reprodukovatelnou peptidovou mapu mAb z malých mikrobioreaktorových vzorků. Díky vysoké přesnosti a propustnosti je vhodná pro moderní bioprocesní vývoj a QA/QC.

Reference

1. Lange I., Chhatre S., Zoro B. Reducing Timelines in Early Process Development – Using a Multiparametric Clone-Selection and Feed-Optimization Strategy. Bioprocess International, 2014.
2. Ren D. et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Analytical Biochemistry, 392 (2009) 12–21.
3. Hanna C.M., Koza S.M., Yu Y.Q. Automated High-Throughput N-glycan Labelling and LC-MS Analysis for Protein A Purified Monoclonal Antibodies. Waters Application Note, 2023.
4. Ippoliti S. et al. Versatile and Rapid Digestion Protocols for Biopharmaceutical Characterization Using RapiZyme™ Trypsin. Waters Application Note, 2023.
5. Finny A.S. et al. Fast and Robust LC-UV-MS Based Peptide Mapping Using RapiZyme™ Trypsin and IonHance™ DFA. Waters Application Note, 2023.