Quick and Robust Sample Preparation for Tryptic Peptide Mapping With the PeptideWorks Kit Using Simple, Automatable Workflows

Význam tématu

Aplikace peptide mappingu je klíčová pro kontrolu kvality, vývoj a výzkum bioterapeutik. Peptidová mapa odhaluje primární strukturu proteinu a umožňuje srovnání referenčního a testovaného vzorku s vysokou reprodukovatelností přípravy.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je demonstrovat automatizovaný protokol přípravy vzorků pro tryptickou digesci pomocí PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit. Studie porovnává manuální a automatizované workflow, zhodnocuje rychlost, úplnost digesce a míru metodou indukovaných modifikací.

Použitá metodika

Proteiny (NISTmAb) byly denaturovány, redukovány dithiothreitolem, alkylovány iodoacetamidem a desalinizovány před digescí. Následovala digesce s RapiZyme Trypsin při 37 °C po dobu 30 min v poměru enzym:protein 1:5. Reakce byla ukončena formic acid. Workflow lze provést manuálně nebo na Andrew+ Pipetting Robot ve dvou protokolech (A: denaturace, redukce, alkylace; B: normalizace koncentrace, digesce).

Použitá instrumentace

• Andrew+ Pipetting Robot s Extraction+ Connected Device pro automatizaci přípravy
• ACQUITY UPLC I-Class PLUS se vzorkovým chlazením na 6 °C a kolonkou ACQUITY Premier Peptide CSH C18 (2.1×150 mm, 1.7 µm) při 65 °C
• ACQUITY RDa Detector v režimu ESI+ (50–2000 m/z, full scan s fragmentation cone 60–120 V)
• Software waters_connect pro řízení přístrojů a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Příprava 24 vzorků za méně než 2,5 h (automatizace s normalizací 2 h 40 min; bez normalizace 2 h 30 min)
• Snížení podílu chybějících štěpení o 93 % a nespecifických štěpení o 55 % ve srovnání s vedoucím immobilizovaným trypsinovým kitem
• Vyšší než 88 % pokrytí sekvence u manuální i automatizované přípravy
• Denní variabilita <15 % RSD pro nemodifikované peptidy a <10 % RSD pro relativní množství modifikací

Přínosy a praktické využití metody

PeptideWorks Kit poskytuje reprodukovatelnou a rychlou přípravu digesčních vzorků vhodnou pro QC, bioprocesní monitoring, analytický vývoj i výzkum. Automatizace zvyšuje propustnost a minimalizuje chyby lidského faktoru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných a vysoce propustných řešení pro charakterizaci biologik, hlubší integrace s laboratorními informačními systémy a vylepšení detekce posttranslačních modifikací pomocí pokročilých hmotnostních spektrometrů a iontové mobility.

Závěr

PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit umožňuje rychlou, robustní a vysoce reprodukovatelnou přípravu vzorků pro peptide mapping bez kompromisu ve kvalitě digesce. Metoda přináší významné snížení chybějících i nespecifických štěpení a zajišťuje konzistentní výsledky pro široké spektrum aplikací v oblasti bioterapeutik.

Reference

• Hada V. et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2018
• Ippoliti S. et al., Waters Application Note, 2023
• Finny A. S. et al., Waters Application Note, 2023
• Yang H. et al., Waters Application Note, 2023
• Mouchahoir T., Schiel J. E., Anal. Bioanal. Chem., 2018
• Millan-Martin S. et al., Anal. Bioanal. Chem., 2020
• Dong Q. et al., MAbs, 2018
• Arndt J. R. et al., J. Am. Mass Spectrom., 2021
• Jalili P. et al., Analytix Reporter, 2022