Understanding Toxicity and Formation of Chlorinated Products of 1,3-Diphenylguanidine (DPG) in Water

Význam tématu

1,3-Difenylguanidin (DPG) je běžně uvolňován z opotřebovaných pneumatik a HDPE potrubí používaných ve vodárenských sítích. Přítomnost této sloučeniny ve vodních tocích může představovat riziko pro vodní organismy a lidské zdraví, zejména pokud se při dezinfekci tvoří chlorované vedlejší produkty s potenciálně vyšší toxicitou.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo komplexně zhodnotit cytotoxicitu a vliv na bioenergetiku buněk lidského plicního karcinomu (A549) u DPG a pěti jeho chlorovaných derivátů. Dále se zkoumala tvorba těchto vedlejších produktů při simulované chloraci a chloraminaci ve vodních podmínkách blízkých reálným vodárenským procesům. Studie byla rozdělena do tří fází:

• Hodnocení cytotoxicity alamarBlue a impedančním RTCA testem.
• Analýza buněčné bioenergetiky pomocí Seahorse XF96.
• Simulovaná chlorace/chloraminace a kvantifikace produktů pomocí triple-quadrupole LC/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky A549 byly exponovány testovaným sloučeninám v různých koncentracích; cytotoxicita byla měřena alamarBlue testem a real‐time impedančním testem xCELLigence RTCA eSight. Bioenergetické parametry (OCR) se sledovaly na Seahorse XF96 analyzátoru za přidání oligomycinu, FCCP a rotenonu/antimycin A. Pro simulaci vodárenských podmínek se DPG vystavil volnému chloru a monochloraminu v pufru pH 7,0, sledovalo se zbytkové oxidační činidlo a produkty se stabilizovaly kyselinou askorbovou. Kvantifikace DPG a chlorovaných derivátů proběhla na Agilent 1290 Infinity II HPLC spojeném s Agilent 6495C Triple Quadrupole LC/MS v MRM režimu.

Použitá instrumentace

• Agilent xCELLigence RTCA eSight pro impedanční měření cytotoxicity
• Agilent Seahorse XF96 extracellular flux analyzer pro sledování bioenergetiky
• Agilent 1290 Infinity II HPLC systém
• Agilent 6495C Triple Quadrupole LC/MS systém (MRM režim)
• Agilent E-plate 96 PET a multiwash injector

Hlavní výsledky a diskuse

AlamarBlue test ukázal, že nejméně cytotoxický byl CC15 (EC50 ≈152 μM) a nejvíce DPG, přičemž chlorované deriváty CC11 a CC04 vykazovaly vyšší toxicitu než DPG. RTCA impedanční test po 24 hodinách potvrdil pořadí toxicity CC11 > CC04 > DPG, po 168 hodinách byly všechny chlorované produkty toxičtější než DPG. Bioenergetické testy prokázaly, že kromě CC05 všechny sloučeniny snižovaly mitochondriální bazální respiraci, ATP produkci a zvyšovaly protonový únik, indikující nevratné poškození mitochondrií. Při simulované chloraci vznikaly především di-halogenované produkty CC15, CC05 a CC04, zatímco tri- a tetra-halogenované deriváty se nedetekovaly; v chloraminačních experimentech produkty nevznikly. Nižší molární poměry Cl2:DPG (≤2.8) vytvářely až 42 % di-halogenovaných produktů, při vyšších vypadl větší podíl dalších nestandardizovaných produktů.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow kombinuje rychlé a bezkontaktní in vitro testy cytotoxicity a bioenergetiky s citlivou kvantifikací vedlejších produktů LC/MS, což umožňuje efektivní environmentální screening nových sloučenin a disinfekčních postupů v rané fázi vývoje za účelem minimalizace rizika uvolnění toxických DBP do vodních ekosystémů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření testovacího workflow na širší spektrum průmyslových chemikálií a DBP.
• Integrace s pokročilými monitoringovými technologiemi pro kontinuální kontrolu kvality pitné vody.
• Prohloubení mechanistických studií pomocí toxikogenomiky a proteomiky.
• Automatizace a miniaturizace testovacích platforem pro vysokoprůchodovou analýzu.
• Podpora regulačních opatření a standardizace metodik pro hodnocení DBP.

Závěr

Studie potvrdila vysokou toxicitu chlorovaných derivátů DPG, zejména di-halogenovaných sloučenin, a dokumentovala jejich vznik při chloraci vody. Kombinace in vitro cytotoxicity, bioenergetiky a triple-quadrupole LC/MS analýzy představuje efektivní nástroj pro screening a snížení environmentálních rizik spojených s vodní dezinfekcí.

Reference

1. Jin J. et al. On the Various Roles of 1,3-Diphenylguanidine in Silica/Silane Reinforced SBR/BR Blends. Polymer Testing. 2021;93:106858.
2. Wik A, Dave G. Occurrence and Effects of Tire Wear Particles in the Environment. Environmental Pollution. 2009;157(1):1–11.
3. Scheurer M. et al. Persistent and Mobile Organic Chemicals in Water Resources. Water Supply. 2021;22(2):1575–1592.
4. Schulze S. et al. Occurrence of Emerging Persistent and Mobile Organic Contaminants in European Water Samples. Water Research. 2019;153:80–90.
5. Zahn D. et al. Identification of Potentially Mobile and Persistent Transformation Products. Water Research. 2019;150:86–96.
6. Johannessen C. et al. The Tire Wear Compounds 6PPD-quinone and 1,3-diphenylguanidine in an Urban Watershed. Arch Environ Contam Toxicol. 2022;82(2):171–179.
7. Hou F. et al. Quantification of Organic Contaminants in Urban Stormwater. Anal Bioanal Chem. 2019;411(29):7791–7806.
8. Xie L. et al. Simultaneous Screening for Chemically Diverse Micropollutants. Chemosphere. 2021;273:128524.
9. Tang J. et al. Different Senescent HDPE Pipe-Risk. Environ Sci Pollut Res. 2015;22(20):16210–16214.
10. Dejonckheere G. et al. Allergic Contact Dermatitis Caused by Synthetic Rubber Gloves. Contact Dermatitis. 2019;81(3):167–173.
11. Stalter D. et al. Mixture Effects of Drinking Water Disinfection By-Products. Environ Sci Water Res Technol. 2020;6(9):2341–2351.
12. Xie SH. et al. DNA Damage and Oxidative Stress in Human Liver Cell L-02. Environ Mol Mutagen. 2010;51(3):229–235.
13. Yin J. et al. Comparative Toxicity of Chloro- and Bromonitromethanes in Mice. Chemosphere. 2017;185:20–28.
14. Hrudey SE. et al. Evaluating Evidence for Association of Human Bladder Cancer. J Toxicol Environ Health B. 2015;18(5):213–241.
15. Sieira BJ. et al. Chlorination and Bromination of 1,3-diphenylguanidine and 1,3-di-o-tolylguanidine. J Hazard Mater. 2020;385:121590.
16. dos Santos MM. et al. Genotoxic Effects of Chlorinated Disinfection By-Products of 1,3-diphenylguanidine. J Hazard Mater. 2022;436:129114.
17. Ramis G. et al. Optimization of Cytotoxicity Assay by Real-Time, Impedance-Based Cell Analysis. Biomed Microdevices. 2013;15(6):985–995.
18. Zuo YT. et al. Toxicity of 2,6-dichloro-1,4-benzoquinone and Five Regulated Drinking Water Disinfection By-Products. J Hazard Mater. 2017;321:456–463.