Extraction of a Comprehensive Steroid Panel from Human Serum Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC/MS-MS Analysis

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá příprava vzorků je klíčová pro analýzu steroidních hormonů ze séra pomocí LC-MS/MS. Podpora kapalné extrakce (SLE+) přináší vysoce reprodukovatelné výtěžnosti a efektivní odstranění fosfolipidů, čímž zvyšuje kvalitu dat a zkracuje čas laboratorního zpracování.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat jednoduchý postup pro extrakci širšího panelu steroidů z lidského séra pomocí ISOLUTE SLE+ 400 µL destiček. Metoda má zajistit vysoké a konzistentní recovery, účinné potlačení matricových interferencí a lineární kvantifikaci v rozsahu 5–5000 pg/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Dochucení vzorku: přidání 25 µL metanolického interního standardu (250 pg/mL).
• Nanesení 300 µL séra na SLE+ destičku; aplikace tlaku 2–5 psi; rovnovážnění 5 minut.
• Eluce:
  
  • Pro DHEAS: 2×500 µL ethylacetátu (gravitačně a pod tlakem).
  • Bez DHEAS: 2×500 µL směsi ethylacetát:hexan (75:25, v/v).
• Sušení proudem vzduchu nebo N2 při 40 °C (20–40 L/min, 20 min).
• Rekonstrukce v 200 µL směsi 50:50 mobilní fáze A/B.

Instrumentace:

• UHPLC: Shimadzu Nexera, ACE C18 (100×2,1 mm, 1,7 µm), gradient 50–90 % methanolu s 0,2 mM NH4F, průtok 0,4 mL/min, 40 °C, injekce 10 µL.
• MS: Shimadzu 8060 Triple Quadrupole s ESI, MRM v pozitivním i negativním módu (uvedeny přechody a energie kolizí).
• Biotage PRESSURE+96 Positive Pressure Manifold a Biotage SPE Dry pro sušení vzorků.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla:

• Výtěžností >75 % (ethylacetát) a >80 % (ethylacetát/hexan) pro většinu steroidů; RSD <10 %.
• Účinného odstranění fosfolipidů pro eliminaci matricových interferencí (sledování iontu m/z 184).
• Dobré rozlišení izobarů již při 5 ng/mL.
• Linearity r² >0,99 v rozsahu 5–5000 pg/mL a LOQ v rozmezí <5–1000 pg/mL podle analyzovaného steroidu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zkracuje čas přípravy, odstraňuje problémy s emulzemi, zajišťuje vysokou reprodukovatelnost a efektivní čištění fosfolipidů. Vhodná pro klinické studie, farmaceutický výzkum a QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry:

• Automatizace SLE+ procesů a propojení s online LC-MS.
• Rozšíření panelu o nové steroidní metabolity.
• Využití ekologičtějších rozpouštědel a miniaturizace vzorků.
• Implementace strojového učení pro optimalizaci chromatografických podmínek.

Závěr

Validated metoda s ISOLUTE SLE+ nabízí robustní a citlivý postup pro extrakci komplexního steroidního panelu ze séra. Díky vysokým výtěžnostem, účinnému potlačení fosfolipidů a široké linearitě je metoda vhodná pro náročné bioanalytické aplikace.

Reference

Biotage. Application Note AN890: Extraction of a Comprehensive Steroid Panel from Human Serum Using ISOLUTE SLE+. 2018.