Oligonucleotide Analysis with Ion-Pair Reversed-Phase Chromatography and Agilent 1260 Infinity II Prime LC

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů pomocí iontově párované reverzní fázové chromatografie (IP-RP HPLC) je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality moderních genových terapií, vakcín na bázi mRNA, siRNA i dalších nukleových kyselin. Správná separace a detekce defektů či kontaminant, jako jsou krátké n-1 fragmenty či zbytková hostitelská DNA, zaručuje bezpečnost a účinnost farmaceutických přípravků i bioprocesů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit optimalizaci metody IP-RP chromatografie pro oligonukleotidy na přístroji Agilent 1260 Infinity II Prime LC s kolonou AdvanceBio Oligonucleotide. Autoři porovnali různé iontově párovací činidla (TEAA, DBAA, HAA), gradienty eluce i teplotní podmínky a navrhli výchozí podmínky pro další vývoj metodiky.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf: Agilent 1260 Infinity II Prime LC
• Kolona: Agilent AdvanceBio Oligonucleotide, 2,1×150 mm, 2,7 µm
• Detektor: DAD HS UV 260 nm (flow cell 60 mm)
• Vstřikovaná objem: 5 µl, průtok: 0,6 ml/min
• Teplota kolony: 60 °C; sampler: 4 °C
• Software: Agilent OpenLab CDS 2.6
• Reagencie: triethylamonná octan (TEAA), dibutylamonný octan (DBAA), hexylamonný octan (HAA); acetonitril; kyselina octová

Použitá metodika

Všechny mobilní fáze připraveny na pH 7 přidáním kyseliny octové do 100 mM roztoků příslušného amonného octanu. Fáze A byla tvořena vodou (s iontově párovacím činidlem), fáze B stejným roztokem v acetonitrilu. Gradienty eluce se pohybovaly mezi 10–90 % B v časech 19–30 min; pro optimalizaci zkoumány rychlosti gradientního nárůstu od 1,25 %/min do 0,25 %/min. Analýza zahrnovala standardní ssDNA ladder (dT 15–40 nt) a ssRNA standard (14, 17, 20, 21 nt).

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání iontově párovacích činidel: delší alkylový řetězec zlepšuje rozlišení. HAA poskytlo nejlepší separaci (např. Rs 3,9 pro 19 vs. 20 nt), DBAA střední, TEAA nejhorší.
• Optimalizace gradientu: jemnější gradienty (0,25 %/min) zvýšily rozlišení až na Rs 4,49 pro ssDNA a Rs 4,26 pro ssRNA, avšak za cenu delší doby analýzy a nižší výšky píků (~40 % původní citlivosti).
• Vliv teploty: pro ssDNA se zvyšující teplotou (20→80 °C) došlo ke zlepšení rozlišení a mírnému zkrácení retence, u ssRNA se retence podstatně zkracovala, ale rozlišení zůstalo téměř konstantní. Rozdíl RT mezi 20 nt ssDNA a ssRNA vzrostl z 0,53 min (20 °C) na 1,81 min (80 °C).

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metodika umožňuje rychlý vývoj a validaci separačních podmínek pro různé délky oligonukleotidů. Laboratoře mohou využít doporučené gradientní profily a iontově párovací činidla jako výchozí body pro stanovení kvality biotechnologických produktů, kontrolu impurit i analýzu mRNA a siRNA.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace IP-RP LC s hmotnostní spektrometrií pomocí těkavých iontově párovacích činidel (HFIP, TEAB).
• Vývoj sloupců s optimalizovanými póry pro vysokomolekulární mRNA.
• Automatizované platformy pro vysokoprůchodovou analýzu genových terapií.
• Studium hybridních struktur DNA–RNA duetů pomocí teplotně modulované chromatografie.

Závěr

Agilent 1260 Infinity II Prime LC v kombinaci s kolonou AdvanceBio Oligonucleotide a HAA iontově párovacím činidlem nabízí vynikající rozlišení krátkých i středně dlouhých oligonukleotidů. Výsledky podtrhují význam volby iontově párovacích reagent a optimalizace gradientu i teploty pro spolehlivou separaci a kvantifikaci impurit.

Reference

• Gerd V.; Sonja S. Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Technologies AN 5994-2957EN, 2021.
• Phu D.; Brain A. Fast and High-Resolution Reversed-Phase Separation of Synthetic Oligonucleotides. Agilent Technologies AN 5991-6006EN, 2017.
• Massie J.; Lloyd L. Use Temperature to Enhance Oligonucleotide Mass Transfer and Improve Resolution in Ion-Pair RP HPLC. Agilent Technologies AN 5990-7765EN, 2011.
• Bonilla J. V.; Susan G. S. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. Taylor & Francis, 2011.
• Alexander J. Investigation of Pore Size Effects at Separation of Oligonucleotides Using Ion-Pair RP HPLC. Faculty of Health, Science and Technology, 2019.
• Lingzhi G.; James S. O. Comparing Ion-Pairing Reagents and Sample Dissolution Solvents For Ion-Pairing Reversed-Phase LC/ESI-MS Analysis of Oligonucleotides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28, 339–350.
• Evanna L.; Maria B.; Srivathsan V. The Investigation of DNA and RNA Structural Differences Using Ultra High Performance Liquid Chromatography. Anthropology, 2016, 21.