Oligonucleotide Analysis Using the Agilent InfinityLab Pro iQ and Altura Oligo HPH-C18 Column

Význam tématu

Oligonukleotidové léčivé přípravky (ASO, siRNA) rychle nabývají na významu v léčbě genetických onemocnění a chronických stavů. Přesná kontrola čistoty a identifikace stopových nečistot (zejména n-1 mer truncátů) jsou klíčové pro bezpečnost a účinnost těchto produktů. LC–MS se stal nezbytným nástrojem pro komplexní profilování nečistot a potvrzení molekulové hmotnosti, avšak konvenční ion‑pair reverzní fáze vyžaduje kompromis mezi chromatografickou separací (vyšší koncentrace alkylaminů) a citlivostí MS (nižší koncentrace kvůli potlačení signálu a kontaminaci).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat validní workflow pro analýzu oligonukleotidů kombinací ultra‑inertního sloupce Altura Oligo HPH‑C18 a citlivého detektoru InfinityLab Pro iQ ve spojení s Agilent 1260 Infinity III Prime bio LC. Studie porovnává chování Altura sloupce s klasickým AdvanceBio Oligonucleotide sloupcem při vysokých (100 mM HAA) a nízkých (15 mM HA + HFIP) koncentracích ion‑pair reagenčního systému a ověřuje, zda je možné dosáhnout dobré separace i při MS‑přátelných podmínkách.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Režimy: ion‑pair reverzní fáze s dvěma přístupy mobilních fází: vysokokoncentrovaný HAA (100 mM) v H2O/ACN a MS‑kompatibilní nízká koncentrace HA (15 mM) kombinovaná s HFIP (25 mM) a acetonitrilem.
• Pracovní podmínky: průtok 0,6 mL/min, teplota kolony 60 °C, objem injekce 20 μL, detekce UV při 260 nm. Gradienty byly optimalizovány pro každou mobilní fázi (viz shrnutí níže).
• Analýzy: testovací směsi zahrnovaly oligo dT ladder (15–40 nt) a RNA rozlišovací standard (14, 17, 20, 21 nt).

Klíčové parametry (srozumitelně shrnuto):

• Mobilní fáze HAA: 100 mM hexylammonium acetátu v H2O a v ACN; gradient cílený na dobrou UV separaci.
• Mobilní fáze HA/HFIP: 15 mM hexylamin + 25 mM HFIP (A) a acetonitril (B) pro MS‑kompatibilitu; u Altura kolony v 25. minutě udržován přibližně 72:28 A:B.
• MS nastavení: InfinityLab Pro iQ (ESI negative), v této studii nastaven pro sken m/z 500–1 600 (přístroj podporuje rozsah až m/z 2–1 600), teplota plynu 325 °C, průtok plynu 11 L/min, kapilární napětí 4 500 V, fragmentor rampovaný; skenovací čas ~176 ms (≈5,6 Hz).

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity III Prime bio LC (pumpa G7131C, multisampler G7137C, multicolumn thermostat G7116B).
• Kolony: Altura Oligo HPH‑C18, 2.1 × 150 mm, 2.7 μm (ultra‑inertní hardware) a AdvanceBio Oligonucleotide, 2.1 × 150 mm, 2.7 μm (porovnávaný standard).
• Detekce: Agilent 1260 DAD (260 nm) a Agilent InfinityLab Pro iQ (G6160B) pro MS.
• Software: Agilent OpenLab CDS v2.8 (s dekonvolučními nástroji pro konfirmaci molekulové hmotnosti).

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoká koncentrace HAA (100 mM) vedla u obou sloupců k porovnatelné separaci 39/40 nt oligo dT, což naznačuje, že při dostatečném množství ion‑pair činidla jsou hardwarové rozdíly méně významné.
• Při snížení koncentrace ion‑pair činidla na MS‑přátelnou úroveň (15 mM HA + 25 mM HFIP) se na AdvanceBio kolóně výrazně zhoršila rozlišení 39/40 nt, zatímco Altura Oligo HPH‑C18 zachovala vysokou separaci mezi těmito těžko rozlišitelnými komponentami.
• Altura sloupec vykazoval navíc vyšší intenzity píků (lepší zotavení signálu) při stejném zatížení vzorku, což svědčí o snížených nevýznamných sekundárních interakcích díky ultra‑inertnímu povrchu hardwaru.
• InfinityLab Pro iQ zaznamenal vícezasíťované iontové obálky převážně v rozsahu m/z 500–1 300; získané surové spektra obalení byla dekonvolvací převedena na přesné hmotnosti (cca 4,5–12 kDa pro analyzované oligo dT sekvence), což umožnilo jednoznačnou identifikaci hlavní složky i stopových truncátů.
• Praktickým příkladem byl 39 nt truncát, který byl separován od hlavního 40 nt píku a dekonvolucí potvrzen jako produkt s absencí 304 Da oproti hlavní sekvenci, což umožnilo přesnou strukturální interpretaci nečistoty.

Diskuse: výsledky jasně ukazují, že materiál a úprava hardwaru kolony mohou zásadně snížit potřebu vysokých koncentrací ion‑pair činidel. To otvírá možnost robustních LC–MS metod s lepší citlivostí, menším chemickým šumem a nižšími náklady na reagencie.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zachovat vysoké chromatografické rozlišení při nízkých, MS‑přátelných koncentracích ion‑pair činidel (lepší citlivost MS, méně kontaminace).
• Zvýšená schopnost detekovat a charakterizovat blízce elujících nečistot (např. n‑1 truncáty), což je klíčové pro QC a vývoj oligonukleotidových léčiv.
• Nižší spotřeba reagencií, snížení chemického šumu a úspora provozních nákladů díky ultra‑inertnímu provedení kolony.
• Standardizovaný workflow (Altura kolona + Pro iQ + OpenLab dekonvoluce) nabízí opakovatelné a rychlé ověření molekulové hmotnosti i u větších oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj ultra‑inertních povrchů a nekovových komponent pro LC, které minimalizují sekundární interakce a umožní ještě nižší koncentrace ion‑pair činidel.
• Rozšíření rozsahu a rychlosti MS detektorů (vyšší m/z, vyšší skenovací frekvence) pro spolehlivou analýzu velmi širokého spektra nabitých stavů a větších sekvencí.
• Integrace iontové mobility a vysokorozlišovací MS pro lepší separaci isobarických a izomerických nečistot.
• Automatizace a validace standardních LC–MS protokolů pro QC v biofarmaceutickém průmyslu a regulované prostředí.
• Vývoj alternativních mobilních fází a aditiv, které kombinují výhody ion‑pair separace s kompatibilitou pro MS bez potřeby agresivního čištění přístrojů.

Závěr

Kombinace Altura Oligo HPH‑C18 kolony s ultra‑inertním hardwarovým provedením a Agilent InfinityLab Pro iQ MS umožňuje vysokorozlišovací separaci oligonukleotidů i při MS‑přátelných nízkých koncentracích ion‑pair činidel. Tato konfigurace s dekonvoluční analýzou poskytuje spolehlivé potvrzení molekulové hmotnosti a účinné profilování nečistot, včetně obtížně rozlišitelných n‑1 truncátů. Výsledkem je robustní, citlivý a provozně výhodný workflow vhodný pro vývoj, validaci a QC terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Roberts TC, Langer R, Wood MJ. Advances in Oligonucleotide Drug Delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673–694.
2. Sutton JM, Guimaraes GJ, Annavarapu V, van Dongen WD, Bartlett MG. Current State of Oligonucleotide Characterization Using Liquid Chromatography–Mass Spectrometry: Insight into Critical Issues. J Am Soc Mass Spectrom. 2020;31(9):1775–1782.
3. Chae‑Young R, Brian L. Oligonucleotide Analysis with Ion‑Pair Reversed‑Phase Chromatography and Agilent 1260 Infinity II Prime LC. Agilent Technologies application note. 2022. Publication number 5994‑5323EN.
4. Studzińska S, Rola R, Buszewski B. The Impact of Ion‑Pairing Reagents on the Selectivity and Sensitivity in the Analysis of Modified Oligonucleotides in Serum Samples by Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 2017;138:146–152.