Separation of Trypsin Digested Monoclonal Antibod

Význam tématu

Peptidová mapování monoklonální protilátky je klíčová technika pro detailní charakterizaci proteinových léčiv. Umožňuje ověřit primární strukturu, identifikovat post-translační modifikace a zajistit konzistenci výrobních šarží. Tento přístup podporuje kvalitu, bezpečnost a účinnost biotechnologických produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat robustní metodiku pro separaci a analýzu trypsinem štěpených peptidů referenčního materiálu monoklonální protilátky NIST mAb 8671. Práce představuje optimalizované podmínky kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) pro přesnou a opakovatelnou peptidovou mapu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje reverzní fázovou kapalinovou chromatografii s vysokým rozlišením a hmotnostní spektrometrií se zdokonalenou ionizací:

• Kolona: Shim-pack Arata Peptide C18 (100 × 2,0 mm, 2,2 μm), teplota 50 °C
• Mobilní fáze: A – 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B – 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Gradient: 1 % B (0–0,5 min) → 60 % B (0,5–112 min) → 95 % B (112,05–117 min) → 1 % B (117,01–120 min)
• Průtok: 0,2 mL/min, objem injekce 2 μL
• Hmotnostní spektrometr LCMS-9030: Heated ESI pozitivní režim, rozsah m/z 350–2000, teploty rozhraní 300 °C, blok 400 °C, kapilára 250 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Celkový iontový chromatogram ukázal přesnou separaci peptidů s vysokým poměrem signál/šum a reprodukovatelností retenčních časů. Metoda odhalila většinu očekávaných tryptických fragmentů, včetně klíčových míst glykozylace a dalších modifikací. Detekční limity dovolují spolehlivou identifikaci peptidů i při nízkých koncentracích.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metodika poskytuje:

• Detailní charakterizaci primární struktury a post-translačních modifikací
• Rychlou kontrolu kvality výrobních šarží pro QA/QC
• Podklady pro validaci procesů ve výrobě terapeutických protilátek

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj směruje k vyššímu rozlišení a citlivosti, např. kombinaci dvou rozměrné chromatografie (2D-LC), pokročilým metodám ionizačních zdrojů a vysokým rozlišením Orbitrap či časově-proletovým analyzátorům. Dále se očekává integrace strojového učení pro automatizovanou interpretaci peptidových map a predikci vzniku post-translačních modifikací.

Závěr

Popsaná LC-MS metoda na bázi Shim-pack Arata Peptide C18 kolony poskytuje spolehlivý a citlivý postup pro peptidovou mapu monoklonálních protilátek. Vysoká reprodukovatelnost i schopnost detekce modifikací ji činí vhodnou pro akademický výzkum i průmyslové kontroly kvality.

Reference

1. Shimadzu Corporation. Application Note ERAS-1000-0302. First Edition: Aug. 2022.
2. National Institute of Standards and Technology. Monoclonal Antibody Reference Material 8671, NIST.