Rapid Analysis of 25-Hydroxyvitamin D3, epi-25-Hydroxyvitamin D3, and 25-Hydroxyvitamin D2 in Plasma for Clinical Research Using High-Resolution Mass Spectrometry

Význam tématu

Stanovení 25-hydroxyvitaminu D3, jeho epimeru 3-epi-25-hydroxyvitaminu D3 a 25-hydroxyvitaminu D2 v lidské plazmě je klíčové pro hodnocení vitaminu D u pacientů a pro výzkum jeho vlivu na zdraví.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou LC–HRMS metodu pro simultánní kvantifikaci tří vitamin D metabolitů v klinických vzorcích. Studie demonstrovala použití vysokorozlišovacího Orbitrapu s přesnou hmotnostní spektrometrií a chromatografické separace k rozlišení izobarických sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny precipitací proteinů a následnou SPE na SOLAμ HRP destičkách, což umožnilo eliminaci kroku sušení. Chromatografie probíhala na Dionex UltiMate 3000RS se sloupcem Hypersil GOLD PFP (100×2,1 mm, 1,9 μm) v isokratickém režimu s mobilními fázemi 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a methanolu. Celkový běh trval 5 minut. Detekce byla realizována na Q Exactive Focus Orbitrap s APCI zdrojem v PRM režimu (výběr prekurzoru 2,0 m/z, rozlišení 35 000, HCD fragmentace). Data byly zpracovány v TraceFinder verze 3.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Limit kvantifikace byl 1 ng/mL pro všechny analyty, lineární oblast 1–100 ng/mL. Intraday a mezidenní přesnost (RSD) byla lepší než 7,7 %; přesnost stanovení (recovery) vůči NIST referencím byla v rozmezí 90–114 %. Matricové efekty byly minimální (absolutní recovery 77–104 %, relativní vůči interním standardům 93–117 %). Chromatografická separace zajišťovala plnou baseline separaci 25OHD3 a epi-25OHD3.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza s pěti­minutovým cyklem vhodná pro vysokou propustnost v klinických laboratořích.
• Eliminace sušení vzorku a použití robustní SPE pro úsporu času i nákladů.
• Přesné rozlišení izobarických metabolit poskytuje spolehlivá data pro výzkum a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení čtyřkanálových LC systémů pro další zvýšení throughput.
• Automatizace přípravy vzorků a rozšíření na další vitamin D metabolity.
• Integrace do rutinní klinické diagnostiky a vývoj ambientních ionizačních technik pro rychlé screeningové testy.

Závěr

Navržená LC–HRMS metoda splňuje požadavky klinického výzkumu na citlivost, přesnost i propustnost. Umožňuje spolehlivou kvantifikaci tří klíčových metabolitů vitaminu D v lidské plazmě za pět minut a je připravena pro rozšíření throughputu a další aplikace.

Reference

1. Gao M., Goldberg J., Carrell T., Kozak M. Rapid Analysis of 25-Hydroxyvitamin D3, epi-25-Hydroxyvitamin D3, and 25-Hydroxyvitamin D2 in Plasma for Clinical Research Using High-Resolution Mass Spectrometry. Thermo Fisher Scientific Application Note 636; 2015.