Characterization of mRNA 5’ capping products using an LC-HRAM-MS/MS analytical platform and Thermo Scientific BioPharma Finder software solution

Význam tématu

Charakterizace 5’ cap struktury mRNA je zásadní pro stabilitu, odolnost vůči exonukleázám, export z jádra do cytoplazmy a zahájení translace. V oblasti vývoje mRNA vakcín a terapeutik se přesná analýza capu stává klíčovým kontrolním bodem kvality, ovlivňujícím biologickou aktivitu a účinnost výsledného produktu.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout citlivou a robustní metodu LC-HRAM-MS/MS pro identifikaci, sekvenační potvrzení a relativní kvantifikaci 5’ capu v in vitro transkribovaných mRNA produktech.
• Demonstrovat efektivitu datově závislého tandemového hmotnostního spektrometru a softwaru BioPharma Finder 5.0 při mapování produktů RNase H digesce.

Použitá metodika a příprava vzorku

• Standard decappingu: digesce mRNA enzymem RppH a precipitace LiCl pro vytvoření referenčního vzorku bez capu.
• Digesce vzorku: biotinylovaný 25-mer hybridizační probe s RNA:DNA hybridem a RNase H rozštěpí capovaný a odcapovaný konec.
• Separace: magnetické streptavidinové kuličky, promytí annealing pufrem, eluce 75 % EtOH, sušení ve SpeedVac a resuspense před LC-MS.
• Chromatografie: iontově párová RP na DNAPac RP kolóně (2.1×100 mm, 4 µm), 70 °C, gradient HFIP/TEA voda–methanol.
• Spektrometrie: Orbitrap Exploris 240 v negativním režimu, ddMS2 HCD 20 V, rozlišení 120 000 (MS) a 30 000 (MS/MS).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC systém
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 MS
• Thermo Scientific DNAPac RP kolóna
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder 5.0 a Chromeleon 7.3.1

Hlavní výsledky a diskuse

• 5’ cap a odcapované oligonukleotidy byly jasně separovány a identifikovány s přesností hmotnosti < 5 ppm.
• Poměr detekovaných produktů odpovídal experimentálně nastavenému 4:1 s odchylkou do 4 %.
• MS/MS fragmentační mapy poskytly kompletní pokrytí a potvrdily polohu m7G capu na 5’ konci.
• Automatizované mapování selhání sondy v BioPharma Finder odhalilo nechtěné oligomery a zjednodušilo interpretaci dat.
• Snížení koncentrace sodíku v promývacím pufru minimalizovalo addukci kovu a optimalizovalo citlivost v negativním režimu.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované workflow umožňuje současnou identifikaci, sekvenační potvrzení a relativní kvantifikaci capovaných konců mRNA.
• Metoda je vhodná pro QA/QC laboratoře při vývoji mRNA vakcín a léčiv.
• Automatizované zpracování dat v BioPharma Finder zvyšuje reprodukovatelnost a přesnost výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na analýzu jiných post-transkripčních modifikací mRNA.
• Integrace vysokopropustných přístupů pro screening kapových analogů a optimalizaci capovací účinnosti.
• Využití strojového učení pro rozpoznání neznámých modifikací a vylepšení automatického zpracování spekter.

Závěr

Kombinace LC-HRAM-MS/MS na platformě Vanquish Horizon/Orbitrap Exploris 240 a softwaru BioPharma Finder poskytuje spolehlivou metodiku pro detailní charakterizaci 5’ capu mRNA. Metoda umožňuje přesnou detekci a relativní kvantifikaci, čímž podporuje vývoj a kontrolu kvality mRNA terapeutik.

Reference

1. Malone R.W., Felgner P.L., Verma I.M. Cationic Liposome-Mediated RNA Transfection. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989.
2. Venkatesan S. et al. Modification of the 5’ End of mRNA. J. Biol. Chem. 1980.
3. Shatkin A.J. Capping of Eukaryotic mRNAs. Cell 1976.
4. Henderson J.M. et al. Cap 1 Messenger RNA Synthesis with CleanCap® Analog. Curr. Protoc. 2021.
5. Daffis S. et al. 2′-O Methylation of Viral mRNA Cap Evades IFIT. Nature 2010.
6. Sachs A.B. mRNA Degradation in Eukaryotes. Cell 1993.
7. Sonenberg N. Cap-Binding Proteins in Translation Initiation. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1988.
8. Gallie D.R. Cap and Poly(A) Tail Synergize for Translational Efficiency. Genes Dev. 1991.
9. Cerritelli S.M., Crouch R.J. RNase H Roles in Genome Integrity. DNA Repair 2019.
10. Beverly M. et al. Label-Free Analysis of mRNA Capping Efficiency. Anal. Bioanal. Chem. 2016.