An automated high-throughput workflow for peptide mapping to monitor post-translational modifications (PTMs) of monoclonal antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou třídu bioterapeutik používaných v léčbě nádorových, autoimunitních i zánětlivých onemocnění. Kvalita a stabilita těchto proteinů závisí na přesné karakterizaci jejich primární struktury a modifikací vznikajících po translaci (PTMs). Peptidové mapování prostřednictvím LC–MS je jednou z mála metod schopných detekovat a lokalizovat tyto modifikace na úrovni konkrétních aminokyselin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit automatizovaný vysokoprůtokový workflow pro peptidové mapování pěti komerčně významných monoklonálních protilátek (chimerické, humanizované i plně lidské) s důrazem na reprodukovatelnost, plné sekvenční pokrytí a kvantifikaci vybraných PTMs (deamidace, oxidace, pyroglutaminace, glykování, odštěpení C-terminální lyzinu a N-glykosylace). Digesci zajišťoval Magnetic SMART Digest Trypsin Kit na systému KingFisher Duo Prime a separaci doplnila UHPLC Vanquish Flex s následnou detekcí na orbitrapovém hmotnostním analyzátoru Q Exactive Plus.

Použitá metodika

Vzorky monoklonálních protilátek (2 mg/ml) byly třikrát připraveny a automaticky digesovány na KingFisher Duo Prime za 45 minut při 70 °C pomocí magnetických kuliček Trypsinu. Po digesci následovala redukce DTT, alkylace iodoctanem. Peptidová směs byla injektována na kolonu Acclaim Vanquish C18 (2,1×250 mm, 65min gradient 2–40 % acetonitril/0,1% FA) a analyzována na Q Exactive Plus v režimu datově závislé fragmentace. Data zpracováno v BioPharma Finder 3.0.

Použitá instrumentace

• KingFisher Duo Prime purification system
• Thermo Scientific Magnetic SMART Digest Trypsin Kit (magnetic resin)
• Vanquish Flex Binary UHPLC system s Acclaim Vanquish C18 kolonkou
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer
• Thermo Scientific BioPharma Finder software verze 3.0
• Thermo Scientific Nanodrop 2000 Spectrophotometer

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukce retencí byla výborná (RSD ≤0,14 %), u všech pěti protilátek bylo dosaženo 100% pokrytí sekvence jak pro lehký, tak těžký řetězec. Identifikovány a kvantifikovány byly všechny sledované PTMs:

• Pyroglutaminace N-terminu (>85 % u vybraných pozic)
• Deamidace Asn/Gln (0,06–7,1 % v závislosti na místě a protilátce)
• Oxidace Met/Trp (do 4 %)
• Glykování Lys (<1,6 %)
• Odštěpení C-terminálního Lysinu (67–97 % varianty bez Lysinu)
• N-glykosylace Fc regionu (dominantně biantennární struktury A2G0F/A2G1F/A2G2F, M5)

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace digesce a přípravy vzorku výrazně snižuje variabilitu a hands-on čas, zvyšuje průchodnost a usnadňuje validaci v prostředí QA/QC. Metoda je vhodná pro charakterizaci identity, stability a genetické konzistence mAb sérií během vývoje a kontroly jakosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace robotických platforem pro přípravu vzorků, rozšíření workflow na nové formy bioterapeutik (bispecifické protilátky, ADC), využití pokročilých algoritmů strojového učení pro interpretaci komplexních PTM profilů a standardizace datových formátů pro podporu regulací.

Závěr

Prezentovaný vysokoprůtokový workflow využívající Magnetic SMART Digest a KingFisher Duo Prime v kombinaci s Vanquish Flex UHPLC a Q Exactive Plus poskytuje rychlou, reproducibilní a vysoce citlivou metodu pro komplexní peptidové mapování monoklonálních protilátek včetně detailní charakterizace PTMs.

Reference

1. Reichert JM. Antibodies to watch 2017. MAbs. 2017;9:15.
2. Monoclonal Antibodies Approved by the EMA and FDA for Therapeutic Use (status 2017). ACTIP.
3. Kaplon H, Reichert JM. Antibodies to watch in 2018. MAbs. 2018;10(2):183–203.
4. Hugget B. Public Biotech 2012–the numbers. Nat Biotechnol. 2013;31:697–703.
5. Zhong X, Wright JF. Biological insights into therapeutic protein modifications. Int J Cell Biol. 2013;1–19.
6. Largy E et al. Orthogonal LC–MS methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins. J Chromatogr A. 2017;1498:128–146.
7. Kauffman JS. Analytical testing to support biopharmaceutical products. Biopharm Int. 2007;2:20–25.
8. Knight ZA et al. Phosphospecific proteolysis for mapping sites of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 2003;21:1047–1054.
9. Yang Y et al. Detecting low level sequence variants in recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 2010;2(3):285–298.
10. Ritter NM et al. Stability considerations for biopharmaceuticals. BioProcess Int. 2011.
11. Liu H et al. Glutamine deamidation of a recombinant monoclonal IgG1 antibody. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008;22(24):4081–4088.
12. Haberger M et al. Functional assessment of antibody oxidation by native mass spectrometry. MAbs. 2015.
13. Higel F et al. N-glycosylation heterogeneity and its influence on mAb structure and function. Eur J Pharm Biopharm. 2016;100:94–100.
14. Wiegandt A, Meyer B. N-glycans of cetuximab by integration of LC–MS/MS and 1H NMR. Anal Chem. 2014;86:4807–4814.
15. Dick LW et al. C-terminal Lysine variants in fully human monoclonal antibodies. Biotechnol Bioeng. 2008;100(6):1132–1143.
16. Chelius D et al. Formation of pyroglutamic acid from N-terminal glutamic acid in IgG antibodies. Anal Chem. 2006;78(7):2370–2376.