SMART Digest Peptide Mapping and Quantitation Compendium

Význam tématu

Peptidové mapování je klíčová metoda v charakterizaci bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek (mAb). Umožňuje potvrdit primární sekvenci proteinu, lokalizovat posttranslační modifikace (PTM) jako je glykozylace, oxidace či deamidace a zaručit tak kvalitu, účinnost a bezpečnost léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a prokázat plně automatizované, rychlé a vysoce reprodukovatelné peptidové mapování pro mAb. Srovnány byly modelové proteiny (cytochrom c, somatotropin, infliximab) a pět top-prodávaných mAb (cetuximab, rituximab, bevacizumab, trastuzumab, adalimumab). Hlavními parametry byly čas přípravy, sekvenční pokrytí a množství generovaných PTM artefaktů.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidové mapování probíhalo v následujících krocích:

• Enzymatická štěpení: SMART Digest Trypsin Kit s imobilizovaným a tepelně stabilním trypsinem na magnetických polystyrenových kuličkách
  
• Automatizace: KingFisher Duo Prime purification system s 96-nohým hlubokým destičkovým modulem a inteligentními protokoly v softwaru BindIt™
  
• Snímací platforma UHPLC-UV: Vanquish Flex Binary LC s kolonkou Acclaim VANQUISH C18 (2,2 µm, 2,1×250 mm)
  
• Detekce a analýza: Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap™ MS s BioPharma Option a softwarovým nástrojem BioPharma Finder™ pro identifikaci peptidů a PTM

Hlavní výsledky a diskuse

• Doba digesce byla zkrácena z 12-24 h (klasické in-solution) na 45–60 min včetně přípravy. RSD retenční doby peptidů na UHPLC bylo <0,1 % (n=9).
• Sekvenční pokrytí všech pět mAb dosáhlo 100 % pro lehký i těžký řetězec.
• Reprodukovatelnost uživatelského protokolu: u 20 peptidů z rituximabu RSD plochy <3 % při třech nezávislých operátorech.
• Srovnání PTM (deamidace, oxidace, pyroglutaminace, glycation, odštěpení C-terminálního lysinu, N-glykosylace) prokázalo výrazně nižší uměle indukované modifikace oproti in-solution protokolům, díky neutrálnímu pH a přesné teplotní kontrole.
• Automatizace peptidové digesce s magnetickým nosičem ve spojení s KingFisherem přinesla ~1,5× nižší variabilitu (RSD) než manuální protokol.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlení přípravy vzorků a zkrácení doby analýzy – vhodné pro vysokoprůchodové (high-throughput) laboratoře
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost – klíčové pro QC a GLP prostředí
• Minimální množství vzorku, možnost automatizovaného sledování PTM v rámci multi-atributových metod (MAM)
• Snížení chyb uživatele a rizika vzniku modifikací během přípravy
• Vhodné pro charakterizaci nově vyvíjených mAb, biosimilars i pro rutinní QA/QC kontroly

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další proteázy (chymotrypsin, Lys-C) pro komplementární sekvenční pokrytí
• Integrace imunoafinitní extrakce (SMART Digest IA) pro kvantitativní bioanalytiku v komplexních matricích
• Rozvoj multi-atributových metod s vysoce přesnou kvantifikací PTM a jejich využití v regulovaných laboratořích
• Implementace umělé inteligence pro automatickou interpretaci a pokročilou vizualizaci dat peptidových map
• Využití nano-UHPLC a ultrarychlých gradientů pro další zkrácení doby analýzy

Závěr

Plně automatizovaný protokol SMART Digest Trypsin Kit s magnetickým nosičem v kombinaci s KingFisher Duo Prime a špičkovou UHPLC-MS platformou dosahuje rychlé, reprodukovatelné a citlivé peptidové mapování mAb. Metoda umožňuje 100 % sekvenční pokrytí, minimalizuje přípravu a riziko vzniku artefaktů a otevírá možnosti vysokoprůchodové charakterizace i kvantitativních studií PTM.

Reference

• Chames P. et al. Br J Pharmacol. 2009;157(2):220–33.
• Ecker DM. et al. mAbs. 2015;7(1):9–14.
• Beck A. et al. Anal Chem. 2013;85(2):715–36.
• Ren D. et al. Anal Biochem. 2009;392(1):12–21.
• Rogers RS. et al. mAbs. 2015;7(5):881–90.
• Thermo Fisher Sci. App. Note 21682 (2017).
• Thermo Fisher Sci. BioPharma Finder 3.0 (2017).