Ultra-sensitive LC/MS workflow for in-depth label-free analysis of single mammalian cells with nanodroplet sample processing

Význam tématu

Proteomická analýza na úrovni jednotlivých buněk představuje klíč k pochopení buněčné heterogenity, která může odhalit odlišné fyziologické stavy, reakce na léčbu a biologické mechanismy na úrovni jedné buňky. Zlepšení citlivosti a robustnosti hmotnostní spektrometrie přináší nové možnosti pro kvalitativní a kvantitativní studium proteomu v malých vzorcích bez značení.

Cíle a přehled studie

Autoři představují inovativní LC–MS workflow optimalizované pro analýzu jednotlivých savčích buněk. Hlavním cílem bylo maximalizovat pokrytí proteomu a citlivost metody při zachování label-free přístupu. Klíčovou součástí je použití nanoPOTS platformy pro minimální spotřebu reagencií, kombinované s novou generací Orbitrap Eclipse Tribrid hmotnostního spektrometru doplněného o FAIMS Pro rozhraní.

Použitá metodika a instrumentace

• Izolace a zpracování buněk: nanoPOTS nanodidripetové nanowelly o objemu 200 nL pro minimalizaci kontaktní plochy a ztrát.
• Enzymatická hydrolýza: lys-C a trypsin ve stejném miniaturním objemu.
• Kapalinová chromatografie: Thermo UltiMate 3000 RSLCnano se separačními kolonkami 20–30 µm i.d.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Orbitrap Eclipse Tribrid s FAIMS Pro rozhraním pro redukci chemického šumu a zvýšení dynamického rozsahu.
• Softwarová analýza dat: Proteome Discoverer 2.4 a MaxQuant s režimem Match Between Runs.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný postup identifikoval z jediného HeLa buněčného vzorku bez značení při 2hodinové gradaci a dvou CV nastaveních až 2023 proteinových skupin a 8571 peptidových skupin (FDR ≤ 1 %). Sečtením identifikací mezi běhy vzrostl počet proteinů na ~1300 a peptidů na ~5800. FAIMS Pro interface významně potlačil jednovazné ionty a pročišťoval spektrometrická data, což vedlo k vyšší robustnosti a opakovatelnosti identifikací.

Přínosy a praktické využití metody

• Label-free analýza jednotlivých buněk: bez nutnosti chemického značení.
• Minimální spotřeba vzorku a reagencií díky nanoPOTS, vhodné pro vzácné a cenné buňky.
• Rozšířená dynamická citlivost a selektivita díky FAIMS Pro.
• Aplikovatelné v základním výzkumu, farmaceutickém vývoji, QA/QC a klinické proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s dalšími ion mobility technikami a vysokorychlostními MS platformami.
• Automatizace a paralelizace přípravy vzorků pro vyšší průtok při zachování citlivosti.
• Rozvoj datových analýz a strojového učení pro hlubší interpretaci single-cell proteomiky.
• Potenciál pro multiplexní workflow a cílené kvantitativní aplikace u vzácných buněčných typů.

Závěr

Popsaný ultra-citlivní LC–MS workflow s nanoPOTS a FAIMS Pro interfacingem umožňuje bezprecedentní rozsah detekce proteinu v jednotlivých savčích buňkách bez značení. Tento přístup otevírá nové možnosti pro studium buněčné heterogenity a může být základem pro přenos do klinických a průmyslových aplikací.

Reference

1. Zhu, Y. et al. Nat. Commun. 9, 882 (2018).
2. Schweppe, D. K. et al. Anal. Chem. 91(6), 4010–4016 (2019).