Label-free proteomics performance with the Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer with single-cell sensitivity

Význam tématu

Proteomika založená na LC-MS nabízí hluboký vhled do složení bílkovin v komplexních vzorcích. Její rozšíření na label-free přístupy s vysokou citlivostí až na úroveň jediné buňky otevírá cestu k analýze vzácných nebo velmi omezených vzorků, jako jsou vzorky z mikrobiopsií, buněčné snímky nebo subpopulace buněk v tkáni. Vyšší citlivost a reprodukovatelnost hrají klíčovou roli ve výzkumu nemocí, klinických aplikacích a kvalitativní i kvantitativní průmyslové analytice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkon masového spektrometru Orbitrap Exploris 480 v kombinaci s FAIMS Pro rozhraním pro label-free proteomiku v režimu data-dependent acquistion (DDA). Testovaný rozsah vzorků pokrýval od úrovně jediné buňky HeLa (~0,2 ng) až po 5000 buněk (~1 µg), včetně cross-laboratorní srovnávací studie se třemi laboratořemi.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 MS
• FAIMS Pro ion mobility interface
• Thermo Scientific EASY-nLC 1200 LC systém
• IonOpticks Aurora 25 cm kolona (300 nL/min)
• Acclaim PepMap RSLC C18 50 cm kolona (250 nL/min)
• UltiMate 3000 RSLCnano + PRSO-V2 Sonation column oven

Použitá metodika

Vzorky jedné HeLa buňky byly připraveny na nanoPOTS platformě, standardní HeLa trysinový diges byl ředěn na 0,5–500 ng/µL. LC gradienty trvaly 30–120 min při různých průtocích (250–300 nL/min pro bulk vzorky, ultra-nanoproud 20 nL/min pro single cell). Data se sbírala v DDA režimu (Top20 / Top66), zpracovávala se v Proteome Discoverer 2.4 s SEQUEST a Percolator pro FDR 1 %, doplněné MaxQuant match-between-runs pro LFQ analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost mezi třemi laboratořemi pro 1 µg HeLa digestu dosáhla v průměru ~6700 proteinových skupin s CV<1 % a ~58 000 peptidů s CV<4 %. Nasazení FAIMS Pro rozhraní zvýšilo počet proteinů o ~14 % a peptidů o ~34 %, přičemž dynamický rozsah dosáhl 5,5 dekád. Při nízkých vstupech 10 ng se identifikovalo ~2900 proteinů se CV<2 %. Massová přesnost zůstala pod 3 ppm pro ~90 % PSMs po dobu dvou týdnů externí kalibrace. Citlivost dovolila identifikovat ~7000 proteinů z 200 ng bulk vzorku a přibližně 800 proteinových skupin z jediné buňky.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost analýzy vzácných a velmi malých vzorků bez ztráty pokrytí proteomu
• Vysoká robustnost a reprodukovatelnost v rámci různých laboratoří
• Jednoduché workflow pro vysoce průtokové experimenty i jednotlivé buňky
• Vhodné pro klinické výzkumy, farmaceutickou QC/QC a výzkum biomarkerů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat ve spojení s microfluidními systémy pro ještě nižší odběry, integrací s cílenými kvantitativními metodami (PRM/SRM) a automatizací přípravy vzorků. Rozšíření do klinických laboratoří i aplikací single-cell multi-omics výrazně prohloubí porozumění biologických procesů na úrovni jednotlivých buněk.

Závěr

Orbitrap Exploris 480 s FAIMS Pro interface představuje špičkovou platformu pro label-free proteomiku od jediné buňky po bulk vzorky do 1 µg. Nabízí vynikající citlivost, reprodukovatelnost a dynamický rozsah bez potřeby offline frakcionace, což je zásadní pro velkoplošné a klinické studie.

Reference

1. Kelly R.T. et al. Anal. Chem. 92(3):2665–2671 (2020)
2. Pfammatter S. et al. Mol. Cell. Proteomics July 14 (2018)