Ultra-sensitive LC-MS workflow for in-depth label-free analysis of single mammalian cells with nanodroplet sample processing

Význam tématu

Analýza proteomu na úrovni jednotlivé buňky otevírá nové možnosti v biomedicínském výzkumu, farmaceutickém průmyslu i kvalitativní kontrole. Umožňuje odhalit heterogenitu buněčných populací, identifikovat biomarkery v raných stádiích onemocnění a cíleně sledovat signální dráhy. Díky extrémně nízkým množstvím proteinů v jedné buňce je však nutné vyvinout vysoce citlivé metody zpracování a analýzy vzorků.

Cíle a přehled studie

Studie představuje vylepšený protokol pro bezznačkovou LC-MS analýzu jednotlivých savčích buněk. Cílem bylo optimalizovat nanodropletové zpracování vzorků, separaci peptidů a detekci na orbitrapovém hmotnostním spektrometru s rozšířeným iontovým filtrem FAIMS Pro, aby bylo možné dosáhnout hlubšího proteomického pokrytí a vyšší kvantitativní přesnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Ultraprocesní platforma nanoPOTS minimalizuje objem trávicího roztoku (200 nL) a kontakt vzorku s povrchem, čímž se snižují ztráty proteinů.
Separace peptidů probíhá na 20 µm vnitřním průměru analytickém sloupci v Ultra-low nanoflow RSLCnano systému.
Iontová detekce je prováděna na Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid MS vybaveném FAIMS Pro rozhraním pro potlačení chemického šumu a zvýšení S/N poměru.
Datové soubory byly zpracovány v Proteome Discoverer 2.4 s dvoustupňovým SEQUEST vyhledáváním a následně v MaxQuant pro funkci match between runs.

Hlavní výsledky a diskuse

Bez použití FAIMS Pro bylo z jediné HeLa buňky identifikováno průměrně 400 proteinových skupin z MS/MS a 1000 při využití převodu informací mezi běhy. Nasazením FAIMS Pro centrum zlepšilo potlačení iontů s nábojem +1 a snížilo chemický šum, což vedlo k ~3000 peptidům a ~830 proteinovým skupinám z jediné buňky čistě MS/MS detekcí. S využitím match between runs počet proteinových skupin vzrostl až na ~1300.
Optimalizace fragmentačních schémat ukázala, že HCD detekce v Orbitrapu poskytuje nejlepší kompromis mezi citlivostí a selektivitou. Testy s 0,5 ng standardu HeLa digestu potvrdily možnost identifikace 2023 proteinových skupin a 8571 peptidových skupin během dvouhodinové gradientové analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Ultrasenzitivní workflow umožňuje bezznačkovou analýzu jednotlivých buněk bez potřeby amplifikace signálu či izotopových značek. Metoda je vhodná pro studiá buněčné heterogenity, farmakodynamické studie, biomarkerové pátrání a průmyslovou QA/QC analýzu vzorků s extrémně nízkým obsahem materiálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace mikrofluidických modulů pro automatizované zpracování vzorků
• Využití pokročilých iontových filtrů a víceúrovňové fragmentace pro hlubší proteomické pokrytí
• Implementace strojového učení pro pokročilou analýzu dat a predikci posttranslačních modifikací
• Rozšíření aplikací na klinické vzorky, vzácné buněčné populace a single-cell multiomics integraci

Závěr

Předložená kombinace nanoPOTS zpracování, ultranízkoprůtokové LC separace, Orbitrap Eclipse Tribrid MS a FAIMS Pro rozhraní přináší zásadní nárůst proteomického pokrytí u jednotlivých savčích buněk. Workflow demonstrovalo poprvé identifikaci více než 1000 proteinových skupin z jediné HeLa buňky bez značkování, čímž významně posunulo hranici citlivosti v jednotlivobuněčné proteomice.

Reference

• Zhu Y et al Nat Commun 9, 882 (2018)
• Kelly RT et al Anal Chem 92(3):2665–2671 (2020)
• Schweppe DK et al Anal Chem 91(6):4010–4016 (2019)