Pushing the Limits of Sensitivity: Micropillar Array-Based Chromatography Coupled to a Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer and FAIMS for Low-Input Proteomics

Význam tématu

Proteomická analýza s nízkým vstupem vzorku umožňuje zkoumání vzácných buněčných populací a heterogenity buněk, což je klíčové pro pochopení biologických procesů na úrovni jednotlivých buněk. Tradiční metody vyžadují vysoký počet buněk, což omezuje studie vzácných nebo jedinečných buněčných stavů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit, jak kombinace mikropilarové chromatografie na non-porous μPAC™ koloně a vysokofrekvenční separace iontů FAIMS Pro™ zvýší citlivost a hloubku proteomických analýz při velmi nízkém množství vzorku (500 pg–10 ng proteinu). Autoři představili nový kolonký prototyp optimalizovaný pro nízké vstupy a integrovali FAIMS před iontovým vstupem do Orbitrap Exploris™ 480.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Thermo Scientific™ Pierce™ HeLa a K562 celulární lyzáty ředěné od 10 ng do 500 pg (ekvivalent 2–4 buněk).
• Chromatografie: non-porous μPAC™ pillar kolonka prototype (PharmaFluidics), provoz při 50 °C, průtok 250 nL/min, přímá injekce 1 µL.
• Separace iontů: FAIMS Pro™ s optimalizovanými kompenzačními napětími pro blokaci jednochargovaných pozadí.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480.
• Analýza dat: Proteome Discoverer™ 2.5 s vyhledáváním Sequest, multiple peptide search (MPS) a spektrální knihovnou predikovanou nástrojem Prosit.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografický výkon μPAC™ kolonek prokázal ostré píky, vysokou opakovatelnost retenčních dob (< 0,3 %) a plošných integrálů (< 6 %). FAIMS významně potlačovalo jednochargované iontové pozadí a zvýšilo intenzity mnohonábojných peptidů při nejnižších vstupech. Z pouhých 500 pg HeLa bylo identifikováno více než 1500 proteinových skupin, zatímco při 10 ng dosáhla studie až ~4200 skupin. Kombinace vyhledávacích strategií ukázala, že nejvyšší proteomické pokrytí přináší predikovaná spektrální knihovna Prosit doplněná o MPS.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol umožňuje hlubokou a reprodukovatelnou proteomickou analýzu z extrémně malých vzorků. Otevírá cestu k single cell proteomice, analýzám vzácných buněk v klinickém výzkumu či QA/QC aplikacím v biotechnologiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další optimalizace FAIMS kompenzačních napětí a designu mikropilarových kolonek může posunout citlivost ještě níže. Využití umělé inteligence a strojového učení při vyhledávání a predikci spekter zvýší pokrytí proteomu. Rozšíření na jiné biologické matrice (biopsie, cirkulující nádorové buňky) představuje slibný směr dalšího vývoje.

Závěr

Kombinace non-porous μPAC™ chromatografie a FAIMS Pro™ před Orbitrap Exploris™ 480 dosahuje vynikající citlivosti, hloubky a reprodukovatelnosti proteomických profilů z femtogramových až pikogramových vstupů. Tento přístup představuje významný krok směrem k rutině single cell proteomiky.

Reference

1. Zhu Y, Piehowski PD, Kelly RT, Qian WJ. Expert Rev Proteomics. 2018 Nov;15(11):865-871.
2. Shen H, Zhang L, Newitt R, Aebersold R, Dovichi NJ. Anal Chem. 2003;75(14):3502-3505.
3. Stadlmann J, Hudecz O, Krššáková G, Ctortecka C, Van Raemdonck G, Op De Beeck J, Desmet G, Penninger JM, Jacobs P, Mechtler K. Anal Chem. 2019;91(22):14203-14207.
4. Gessulat S, Schmidt T, Zolg DP et al. Nat Methods. 2019;16:509–518.