1000 Proteins Per Hour [pph] Maximizing Protein ID From Complex Mixtures

Význam tématu

Proteinová identifikace komplexních směsí je zásadní pro hluboké pochopení biologických procesů, vývoj biomarkerů a farmaceutický výzkum. V proteomice hraje klíčovou roli schopnost detekovat co nejvíce proteinů za co nejkratší dobu, přičemž je nutné udržet vysokou citlivost a přesnost hmotnostního určení. Hybridní technologie iontové pasti a Orbitrap analyzátoru slibuje posun těchto hranic a řešení problému podvzorkování (undersampling) u složitých proteomů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je zhodnotit výkonnost nového hmotnostního spektrometru Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos při analýze proteolytického digestu bakterie Escherichia coli. Autoři porovnali dvě strategii fragmentace – datadependentní TOP20 CID a datadependentní TOP10 HCD – na vzorcích o hmotnostech 1 µg, 100 ng a 20 ng proteolytického digestu odděleného nanoLC 60min a 90min gradientem.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: E. coli whole cell lysát redukovaný DTT, alkylace iodoacetamidem, tryptická digesce (16 h, 37 °C).
• Chromatografie: Thermo Scientific Surveyor LC s MicroAS autosamplerem, trap kolona 100 µm × 2 cm, analytická kolona 75 µm × 10 cm (3 µm částice), gradient 2–30 % acetonitril v 60 a 90 min, průtok 300 nL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos hybrid (S-Lens progresivní iontový vodič, dvouúrovňová iontová past, HCD článek, vylepšené vakuum).
• Akvizice dat: ddTOP20 CID (1x full scan v Orbitrapu + 20 MS/MS v LTQ) a ddTOP10 HCD (1x full scan + 10 MS/MS v Orbitrapu).
• Softwarové zpracování: Proteome Discoverer v1.2 s vyhledávacím algoritmem Mascot, filtrování na FDR < 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro 1 µg digestu a 60min CID bylo identifikováno 1050 unikátních proteinů (6582 peptidů). U 100 ng/CID 787 proteinů (5339 peptidů) a u 20 ng/CID 422 proteinů (3765 peptidů).
• Pro 1 µg digestu a 90min HCD získáno 1059 proteinů (6344 peptidů). Snížení množství vzorku na 100 ng dalo 787 proteinů a 5339 peptidů, 20 ng 422 proteinů a 3765 peptidů.
• Srovnání CID vs. HCD ukázalo 81 % shodu na proteinové a 68 % na peptidové úrovni. HCD poskytuje vyšší kvalitu spekter a lepší detekci modifikovaných peptidů.
• Nový systém dosahuje rychlosti až 10 sekvenčních MS/MS spekter za sekundu, dramaticky snižuje doby plnění pasti a zvyšuje citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoká rychlost a citlivost výstupu umožňuje:

• Analýzu slabě zastoupených proteinů v komplexních směsích.
• Průmyslové QA/QC postupy s vysokým throughputem.
• Farmaceutický výzkum a vývoj biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• De novo sekvenace složitých peptidů díky vysoké hmotnostní přesnosti MS/MS spekter.
• Kvantitativní proteomika značených vzorků (SILAC, TMT) s využitím HCD pro přesnější kvantifikaci.
• Studium posttranslačních modifikací (fosforylace, glykosylace) vyžadujících vysokou rozlišovací schopnost.
• Integrace s pokročilou bioinformatikou a strojovým učením pro rychlejší interpretaci dat.

Závěr

Hybridní LTQ Orbitrap Velos kombinuje vysokou rychlost MS/MS spektrální akvizice s vynikající hmotnostní přesností a citlivostí. Umožňuje identifikaci více než 1000 proteinů za hodinu z komplexních proteomických vzorků, čímž výrazně posouvá hranice pokrytí proteomu a otevírá nové možnosti pro biomedicínský výzkum.

Reference

1. Wouters ER, Splendore M, Senko MW, Syka JE, Dunyach JJ. Ion Transmission at High Pressure. ASMS 2008.
2. Pekar T, Blethrow JD, Schwartz JC, Merrihew J, MacCoss MJ, Swaney DL, Russell JD, Coon JJ. Dual‐Pressure Linear Ion Trap Mass Spectrometer with Very High Sequencing Speed. Mol Cell Proteomics. 2009 Dec;8(12):2759–69.
3. Olsen JV, Schwartz JC, Griep‐Raming J, Nielsen ML, Damoc E, Denisov E, Lange O, Remes P, Taylor D, Splendore M. Improving the Analysis of Complex Protein Mixtures. Anal Chem. 2009;81:7757–65.