Comprehensive identification and label-free quantitation of host cell protein contaminants using BioPharma Finder 4.1 software

Význam tématu

Hostitelské proteiny (HCP) jsou nízkomolekulární nečistoty vznikající v biotechnologické výrobě monoklonálních protilátek. Mohou ovlivnit kvalitu, bezpečnost i stabilitu léčiva, proto je jejich sledování a odstranění nezbytné pro splnění požadavků regulačních norem.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo detekovat, identifikovat a bezznačkově kvantifikovat zbytkové HCP v investigativní monoklonální protilátce IgG1 během Protein A purifikace. Byla sledována změna profilu HCP mezi ranými a pozdními cykly purifikace a ověřena použitelnost software BioPharma Finder 4.1 v rámci peptide mapping analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: CHO expresní systém, clarifikace a Protein A afinitní chromatografie pomocí HiTrap Protein A kolony.
Digestion: redukce, alkylace, 18hodinová tryptická digestace, C18 desalting.
Chromatografie a MS: Thermo Vanquish Flex UHPLC s Acclaim VANQUISH C18 kolonnou, lineární gradient 2–40 % organiky za 45 min, Q Exactive Plus Orbitrap v DDA režimu (MS1 70 000 rozlišení, Top5, MS2 17 500).
Software: BioPharma Finder 4.1 pro peptide mapping a HCP kvantifikaci, Chromeleon CDS 7.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzou bylo detekováno 124 proteinů, po aplikaci filtrů (≥2 jedinečných peptidů, ASR ≤1,5, jedinečné peptidy) 19 HCP a nakonec 10 proteinů s min. 3 peptidy pro kvantifikaci. Srovnání poměru středních MS ploch mezi DSP-Stage2 a DSP-Stage1 ukázalo, že po ~120 cyklech Protein A byla většina HCP snížena na cca 50 %, nicméně některé (např. Nidogen-1, EF2) zůstávají déle přítomné. Label-free přístup umožnil odhad HCP hladin v rozmezí několika ppm až jednotek tisíc ppm.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí rychlý a spolehlivý protokol pro identifikaci a kvantifikaci HCP v mAb, podporuje optimalizaci čistících procesů, zajišťuje důležité vstupy pro rozhodování v rámci vývoje a kontroly kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možná integrace s vysokokapacitními hmotnostními přístupy, rozšíření databází pro hlubší proteomické pokrytí, kombinace s imunochemickými testy a automatizace pro online monitoring a procesní kontrolu v reálném čase.

Závěr

BioPharma Finder 4.1 v kombinaci s HRAM-MS peptide mappingem představuje efektivní nástroj pro sledování a kvantifikaci HCP, čímž podporuje robustní design a validaci downstream purifikačních procesů monoklonálních protilátek.

Reference

1. Zuch de Zafra C.L. et al. Biotechnol. Bioeng. 2015;112:2284–2291.
2. ICH Q11 Guideline. 2012.
3. ICH Q6B Guideline. 1999.
4. Liu H.F. et al. MAbs 2010;2(5):480–499.
5. Albrecht S. et al. Biotechnol. Bioeng. 2018;115(6):1509–1520.
6. UniProt CHO proteome UP000001075.
7. Comet MS/MS sequence database search tool.
8. Van de Peer Y. Bioinformatics Venn tool. 2009.
9. Gilgunn S. et al. J. Chromatogr. A 2019;1595:28–38.
10. Grossmann J. et al. J. Proteomics 2010;73:1740–1746.