Negative Mode Analysis of Synthetic Oligonucleotides using the MALDI-8030 Dual Polarity Benchtop MALDI-TOF Mass Spectromet

Význam tématu

MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie představuje rychlý a citlivý způsob analýzy syntetických oligonukleotidů. Negativní iontový mód výrazně eliminuje addukty sodíku a draslíku a zjednodušuje přípravu vzorků. Metoda nachází uplatnění v genotypizaci, kde nabízí alternativu ke klasické PCR s následnou gelovou elektroforézou a barvením etidium bromidem.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat schopnost benchtop lineárního MALDI-TOF spektrometru MALDI-8030 v obou polaritách pro genotypizaci oligonukleotidů modelově reprezentujících mutace CFTR genu u cysticklé fibrózy. Zaměřuje se na tři genotypy: divoký typ, homozygotní mutaci Phe508del a heterozygotního nositele.

Použitá metodika a instrumentace

• PCR syntetické oligonukleotidy obsahující sekvence ATCTTTGGTGTT a ATTGGTGTT
• Matice 3-hydroxypikolínová kyselina (3-HPA) připravená v amoniu citrátu
• Desalting pro pozitivní mód pomocí Dowex iontově výměnné pryskyřice
• Analýza na MALDI-8030 benchtop lineárním MALDI-TOF v pozitivním a negativním iontovém módu

Hlavní výsledky a diskuse

Negativní iontový mód odstranil solné addukty bez nutnosti desaltingu a generoval čistá spektra bez kompromisů na citlivosti. Všechny tři genotypy oligonukleotidů byly detekovány s vysokou přesností hmotnosti. Pozitivní mód i po čištění vykazoval drobné addukty Na+ a K+.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení času a zjednodušení pracovního postupu oproti gelové elektroforéze s etidiovým barvením
• Využití ve výuce laboratorních genotypizačních technik
• Možnost rutinní aplikace v kontrolních a diagnostických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj multiplexních analýz více mutací souběžně, automatizace přípravy vzorků a integrace s dalšími separačními a hmotnostními metodami pro zvýšení throughputu a robustnosti.

Závěr

Dual polarity MALDI-8030 nabízí spolehlivou a efektivní genotypizaci syntetických oligonukleotidů v negativním módu bez složitého čištění vzorků. Metoda představuje účinnou alternativu k tradičním PCR-elektroforézním postupům.

Reference

• Hakkak A M, Mehdizadeh A, at al. Analysis of CFTR gene mutations in children with cystic fibrosis first report from North East of Iran. Iranian Journal of Basic Medical Sciences 16(8):917 (2013).
• Ferrie R M, at al. Development multiplexing and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene. American Journal of Human Genetics 51(2):251 (1992).
• Frentescu L, at al. Study of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations in a group of patients from Romania. Journal of Cystic Fibrosis 7(5):423-428 (2008).
• Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP NCBI documentation (2021).
• Srinivasan S, Batra J. Single Nucleotide Polymorphism Typing. (2019):432-440.
• Peng B Y, at al. A novel and quick PCR based method to genotype mice with leptin receptor mutation db/db mice. Acta Pharmacologica Sinica 39(1):117-123 (2018).