Oligonucleotide Therapeutics Solution Guide

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie představují moderní třídu léčiv založenou na chemicky syntetizovaných krátkých řetězcích nukleových kyselin. Díky schopnosti přímé modulace genové exprese a vysoké selektivitě cíle nabízejí nové možnosti léčby geneticky podmíněných onemocnění, infekcí či nádorů. Vývoj validních analytických postupů pro purifikaci, charakterizaci a kontrolu kvality oligonukleotidů je klíčový pro zajištění jejich bezpečnosti, stability a účinnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představení koncepce workflow pro vývoj oligonukleotidových terapeutik, včetně klíčových analytických etap:

• výběr cílové sekvence a chemické modifikace
• syntéza a purifikace oligonukleotidů
• podrobná charakterizace stability, termodynamiky a sekvence
• kvantitativní stanovení a kontrola kvality

Text shrnuje dostupné technologie a instrumentaci potřebnou pro každou fázi.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow vývoje oligonukleotidů se skládá z několika navazujících kroků:

• Syntéza a purifikace: chromatografie výměnou iontů (IEX) a iontově párovaná RP-UHPLC
• Kontrola stability a hybridizace: měření teploty tání (Tm) a analýza termodynamických parametrů
• Potvrzení sekvence a molekulární hmotnosti: MALDI-TOF MS a ESI-QTOF/Triple quadrupole MS
• Kvantifikace: MRM na triple quadrupole a UV/Vis spektrofotometrie pro stopová měření

Hlavní přístroje a systémy:

• UHPLC systém Nexera XS inert s inertními cestami vzorku, ventily a detektory SPD-M40/M40V
• Kolonové kazety Shim-pack Bio IEX Q-NP a Scepter C18-120
• Spectrofotometr UV-2600i s modulovým termalním blokem TMSPC-8
• MALDI-TOF MS: MALDI-8020 (pozitivní mód) a MALDI-8030 (duální mód)
• Q-TOF MS LCMS-9030 (ESI-QTOF) pro exaktní hmotnostní měření
• Triple quadrupole MS LCMS-8060 a LCMS-8060NX pro kvantitativní MRM a molekulární hmotnost
• Spektrofotometr UV-1900i s TrayCell/Nano Stick pro mikrovzorky
• Microvolume fotometr BioSpec-nano pro měření 1–2 µl vzorků

Hlavní výsledky a diskuse

• IEX-UHPLC na Nexera XS inert umožňuje reprodukovatelnou separaci krátkých oligonukleotidů dle délky (16–20 mer) s RSD <1 % pro retenční časy a plochy.
• Reverzní RP-UHPLC s iontovým párováním (DBA) a Method Scouting systémem zrychluje vývoj separačních metod pro oligonukleotidy až do 30 mer.
• Analýza Tm na UV-2600i+TMSPC-8 poskytuje přesné stanovení teplot tání dsdna a umožňuje výpočet entalpie, entropie a Gibbsovy energie z koncentrační závislosti Tm.
• MALDI-ISD na MALDI-8030 zajišťuje jednoduché sekvenační informace z interních fragmentů (w- a a-ionty) bez nutnosti MS/MS.
• ESI-QTOF LCMS-9030 dosahuje exaktních monizotopických hmot s chybou do 0,05 ppm a ESI-MALDI komplementarita umožňuje kompletní charakterizaci sekvence.
• Triple quadrupole LCMS-8060/8060NX dokáží v rámci jednoho systému kvantifikovat oligonukleotidy v MRM režimu (1–300 ng/ml) i odhadovat molekulární hmotnost pomocí dekonvoluce.
• UV-Vis spektrofotometry UV-1900i a BioSpec-nano umožňují kvantitativní měření dsDNA ve stopových koncentracích (do desítek ng/µl) s vysokou linearitou a minimálním objemem vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Soubor technologií a instrumentace představených ve studii:

• zrychluje vývoj a validaci oligonukleotidových léčiv
• zajišťuje vysokou reprodukovatelnost a přesnost analytických dat
• umožňuje komplexní kontrolu kvality (identita, čistota, koncentrace, termická stabilita, sekvence)
• minimalizuje ztráty vzorku a časové nároky díky inertním cestám vzorků a automatizovaným funkcím (Method Scouting, TrueClean)

Budoucí trendy a možnosti využití

Dynamický rozvoj oligonukleotidové terapie směřuje k implementaci:

• pokročilých modifikací (LNA, 2′-MOE, CpG motif) pro vyšší stabilitu a cílovou doručitelnost
• integrovaných high-throughput platforem pro paralelní screening a charakterizaci
• nových DDS (drug delivery systems) založených na nanomateriálech a ligandových nosičích
• kombinace multi-omics dat a AI-poháněné optimalizace analýzy genové exprese

Závěr

Prezentované pracovní postupy a instrumentace tvoří komplexní řešení pro purifikaci, charakterizaci a kvantifikaci oligonukleotidových terapeutik. Spojením pokročilých chromatografických technik, spektrometrie hmotnosti, spektroskopie a mikroobjemových měřicích nástrojů lze dosáhnout vysoké kvality dat a zrychlit vývoj nových léčebných přístupů.

Reference

1) Shimizu H. et al. J Mass Spectrom. 2012 Aug;47(8):1015–1022.
2) Shimadzu Application Notes a White Papers k produktům Nexera XS inert, LCMS-9030, MALDI-8030, UV-1900i a BioSpec-nano.