Negative Mode Analysis of Synthetic Oligonucleotides using the MALDI-8030 Dual Polarity Benchtop MALDI-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza syntetických oligonukleotidů hraje klíčovou roli v molekulární biologii, genotypizaci a diagnostice mutací. MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie v negativním módu umožňuje rychlou a spolehlivou detekci bez vlivu solných aduktů, čímž zjednodušuje workflow oproti standardní elektroforéze s barvením ethidiovým bromidem.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit schopnost benchtop MALDI-8030 ve dvou polaritách pro detekci PCR produktů reprezentujících různé genotypy CFTR mutace Phe508del a porovnat výstupy pozitivního a negativního módu.

Použitá metodika a instrumentace

• Syntetické oligonukleotidy: ATCTTTGGTGTT (wild type), ATTGGTGTT (Phe508del).
• Matrix: 3-hydroxypicolinová kyselina s amoniovým citrátem dibazickým.
• Čištění vzorků: Dowex ion exchange resin (pouze pro pozitivní mód).
• Spektrometrie: MALDI-8030 Dual Polarity Benchtop MALDI-TOF Mass Spectrometer.

Hlavní výsledky a diskuse

• Negativní ionizace efektivně odstraňuje solné adukty bez potřeby desaltingu.
• Detekce tří genotypů CFTR: wild type (m/z 3656,43), homozygot Phe508del (m/z 2758,85), heterozygot s oběma formami.
• Spektra v negativním módu vykazují vyšší čistotu a srovnatelnou citlivost oproti pozitivnímu módu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí zkrácený a méně pracný postup pro genotypizaci po PCR vhodný pro výuku i rutinní diagnostické laboratoře. Umožňuje rychlou validaci PCR produktů bez gelové elektroforézy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní analýza více mutací v jediném měření.
• Rozšíření na klinické diagnostické testy a high-throughput screening.
• Integrace do výukových laboratoří pro praktické seznámení studentů s MS technikami.

Závěr

Negativní ionizace na platformě MALDI-8030 představuje efektivní a ekonomickou alternativu k tradičním metodám detekce PCR produktů. S minimální přípravou vzorku a kvalitními spektry podporuje širší využití v akademické i komerční praxi.

Použitá instrumentace

• MALDI-8030 Dual Polarity Benchtop MALDI-TOF Mass Spectrometer
• 3-HPA matrix, amoniový citrát dibazický
• Dowex ion exchange resin

Reference

1. Hakkak A. M. et al. Analysis of CFTR gene mutations in children with cystic fibrosis. Iranian J Basic Med Sci. 2013;16(8):917.
2. Ferrie R. M. et al. Development, multiplexing, and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene. Am J Hum Genet. 1992;51(2):251.
3. Frenţescu L. et al. The study of CFTR gene mutations in patients from Romania. J Cyst Fibros. 2008;7(5):423–428.
4. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). NCBI Probes. 2021.
5. Srinivasan S., Batra J. Single Nucleotide Polymorphism Typing. 2019.
6. Peng B.-y. et al. A novel PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation. Acta Pharmacol Sin. 2018;39(1):117–123.