Novel ion activation workflows in the hybrid Orbitrap-Omnitrap platform empower top-down and bottom-up proteomics

Význam tématu

Pokročilé ionizační a fragmentační techniky jsou zásadní pro hlubokou charakterizaci proteomů. Hybridní platforma Orbitrap-Omnitrap umožňuje spojit top-down i bottom-up přístupy v jednom systému, což přináší vyšší sekvenční pokrytí, lepší rozeznání proteoform a schopnost detailní analýzy posttranslačních modifikací. Tato technika usnadňuje výzkum v biochemii, farmaceutických aplikacích i klinické proteomice.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo představit novou řadu ionizačních workflow na platformě Omnitrap integrované s Orbitrap hmotnostním analyzátorem. Autoři demonstrovali:

• Komplementaritu a synergii různých iontových aktivací (ECD, EID, HCD, IAD, HAA, PD).
• Vyšší účinnost v bottom-up analýze na modelovém BSA tryptickém digestu.
• Unikátní multidimenzionální postupy tandemové masové spektrometrie pro top-down analýzu intaktních proteinů (ubiquitin).

Použitá metodika

Bottom-up analýza proběhla s chromatografickým rozdělením na 25 cm PepSep C18 kolóně v režimu DDA na Q Exactive HF™. Elektronická aktivace EID byla prováděna v čase 50 ms, ECD v čase 80 ms. Pro top-down experimetry byly generovány radikálové ionty ubiquitinu pod nativními podmínkami a následně fragmentovány pomocí šesti aktivací: ECD, EID, HCD, IAD, HAA a vakuové ultrafialové fotodissociace (PD).

Použitá instrumentace

• Omnitrap™: segmentovaný lineární RF iontový past.
• Q Exactive HF™ Orbitrap™ s Biopharma volbou.
• Exploris™ 480 Orbitrap™ MS s FTMS Booster datovým akvizičním systémem.
• Modifikovaný HCD koloběhový článek s bezztrátovým přenosem iontů mezi HCD a Omnitrap.
• Elektronový zdroj, vakuová UV světelná buňka (VUV), pulzní plynulý přívod, hexapólové a kvadrupólové segmenty (Q2, Q5, Q8).

Hlavní výsledky a diskuse

V bottom-up analýze BSA tryptického digestu dosáhla metoda EID sekvenčního pokrytí až 97 % u 2+ peptidů a průměrného pokrytí nad 80 % pro vyšší náboje. ECD bylo komplementární s pokrytím kolem 91 %. HCD dosáhla průměrně 89 %. Celkově bylo identifikováno 18 907 MS/MS spekter, z toho 14 608 HCD, 3 094 EID a 2 598 ECD PSMs.
Top-down analýza intaktního ubiquitinu ([M+8H]8+) ukázala 100 % sekvenční pokrytí u aktivací EID, ECD, IAD, HAA a PD. EID poskytla nejvíce a- a x-typů fragmentů (a:97 %, x:89 %), ECD obohatilo c- a z-typy, IAD umožnilo rozlišení leucin/isoleucin charakteristickým štěpením, PD nabídla široké rozložení radikálových iontů.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma poskytuje:

• Rychlou a efektivní bottom-up analýzu přímo na chromatografických časových škálách.
• Vysoce pokročilé top-down workflow pro charakterizaci intact proteoforms.
• Komplexní rozlišení izomerů a detailní lokalizaci PTM.
• Lepší signál-šum díky iontové akumulaci v Omnitrap a FTMS Boosteru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Integraci se špičkovými separačními technikami (UHPLC, kapilární elektroforéza).
• Automatizaci a vysokopropustné workflow pro klinickou proteomiku.
• Rozšíření do strukturalní proteomiky a analýzy fakultativních komplexů.
• Využití strojového učení pro interpretaci komplexních MS/MS spekter.

Závěr

Hybridní Orbitrap-Omnitrap platforma s inovativními iontovými aktivacemi nabízí vynikající sekvenční pokrytí v bottom-up i top-down proteomice. Tím výrazně zvyšuje hloubku analýzy, schopnost rozlišovat proteoformy a detailně mapovat modifikace, čímž otevírá nové možnosti pro biochemický výzkum i průmyslové aplikace.