Top-down Analysis of Intact Antibodies under Denatured and Native Conditions on the Omnitrap Platform Coupled to an Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují jeden z nejrychleji rozvíjejících se segmentů biologické léčby. Jejich detailní strukturní charakterizace je nezbytná pro ověření kvality, bezpečnosti a účinnosti farmaceutických produktů. Top-down hmotnostní spektrometrie umožňuje analýzu intactních protilátek bez nutnosti štěpení na peptidy, čímž poskytuje komplexní pohled na jejich modifikace a mnohých strukturálních vlastností.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené práce bylo vyhodnotit možnosti top-down analýzy intactních monoklonálních protilátek (na příkladu Herceptinu®) za denaturovaných i nativních podmínek s využitím Omnitrap platformy propojené s Orbitrap analyzátorem. Studie kombinovala různé fragmentační techniky a hodnotila účinnost detekce primárních i interních fragmentů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu intactních protilátek byla použita Omnitrap platforma integrovaná s Thermo Scientific Q Exactive Plus (Biopharma modul). Vzorky Herceptinu byly připraveny dvěma způsoby:

• Native podmínky: výměna pufru do 100 mM acetátu amonného, koncentrace 5 µM.
• Denaturované podmínky: roztok voda:acetonitril (50:50, v/v) s 0,1 % kyseliny mravenčí.

Ionizace probíhala statickou nanoESI pomocí natáhnutých borosilikátových emitérů. Fragmentace intenzivními technikami zahrnovala:

• Slow heating CID se širokopásmovou excitací vyšších m/z fragmentů.
• Elektronovou zachycovací disociaci (ECD) na náboji 49+.
• Kolizně aktivovanou ECD (CA-ECD) na stejných prekurzorech.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace fragmentačních podmínek přinesla následující klíčové poznatky:

• V MS2 CID se díky širokopásmové excitaci vyšších m/z fragmentů výrazně zvýšil poměr signál/šum, což umožnilo detekci nových b- a c-terminálních iontů.
• Zavedením CA-ECD se podařilo rozšířit pokrytí sekvence zachycením primárních i interních fragmentů. Celkové přiřazené signály se zvýšily z 48 % až na 73 % při zahrnutí interních fragmentů.
• Ve spektru CA-ECD byla identifikována řada C-terminálních fragmentů nesoucích glykosylace G0F a G1F.

Celkově kombinace fragmentačních režimů na Omnitrap platformě přinesla komplementární pohled na strukturální charakteristiky intactní protilátky.

Přínosy a praktické využití metody

Top-down přístup na Omnitrap/Orbitrap systému umožňuje:

• Komplexní charakterizaci intactních protilátek včetně PTM a glykosylací.
• Rychlou kontrolu kvality během vývoje a výrobního procesu bioterapeutik.
• Eliminaci potřeby rozsáhlé bottom-up přípravy vzorku a rizika ztráty informací o souběžných modifikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje zahrnují:

• Integrace pokročilých algoritmů pro automatizované vyhledávání a přiřazování fragmentů (např. nástroj PeakFinder).
• Rozšíření aplikace na vyšší řád oligomerů a komplexů protilátek s antigeny.
• Využití v reálném čase pro QC a výrobní monitoring biopharma procesů.

Závěr

Představená studie prokázala, že Omnitrap platforma v kombinaci s Orbitrap analyzátorem umožňuje účinnou top-down analýzu intactních monoklonálních protilátek za denaturovaných i nativních podmínek. Kombinace CID, ECD a CA-ECD přináší komplementární informace vedoucí k širokému pokrytí sekvence a modifikací. Nová softwarová řešení dále usnadní zpracování dat a rozšíří využití této metody v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

V textu nebyly explicitně uvedeny samostatné literární odkazy.