Balancing sensitivity and throughput for the analysis of limited sample amounts in proteomics with ultra-low nano-flow LC-MS

Význam tématu

Analýza omezených množství vzorků v proteomice, včetně single-cell studií, vyžaduje maximální citlivost a současně dostatečnou propustnost pro zpracování velkých sérií vzorků. Kombinace ultra-nízkých nano-flow LC-MS protokolů (<100 nL/min) s optimalizovanými kolonami přináší až desetinásobné zvýšení signálu ve srovnání s konvenčními nano-flow přístupy, což otevírá nové možnosti pro kvantitativní analýzy stopových proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie systematicky hodnotí vliv průtoku (40–100 nL/min) a vnitřního průměru kolon (20 µm a 30 µm) na citlivost a počet identifikací peptidů a proteinů při analýze 1–5 ng HeLa digestu. Cílem bylo vyvinout standardizované workflow pro přímou injekci i past-and-elute režim, které nabídnou optimální kompromis mezi citlivostí a vysokou propustností (až 72 vzorků/24 h).

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo s kapalinami A (0,1 % kyselina mravenčí ve vodě) a B (80 % acetonitril, 0,1 % kyselina mravenčí).
• Kolony: Double nanoViper PepMap Neo (20 µm × 150 mm, 2 µm) pro přímou injekci; Single nanoViper (20 µm × 250 mm, 2 µm) s trap kolónou (30 µm × 2 mm, 3 µm) pro past-and-elute.
• Mass spektrometrie: Thermo Orbitrap Exploris 480 v DDA režimu, data zpracována v Proteome Discoverer 2.5 (Sequest HT, INFERYS, FDR <1 %).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace průtoku ukázala, že nejvyšší počet identifikací (>2000 proteinů při 5 ng digestu) se dosahuje při 50–80 nL/min s gradienty 30–90 min. U nízkých dávek (1 ng) byly lepší výsledky s kratšími gradenty (15–30 min) kvůli vyšší špičkové výšce a úzkým špičkám. Past-and-elute workflow umožnilo zkrátit cykly na 20 min a dosáhnout propustnosti 72 vzorků/24 h při zachování citlivosti. Přímá injekce dosahovala až desetinásobného zvýšení signálu proti 300 nL/min, ovšem delší doby nahrávání vzorku omezují propustnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost pro analýzu subnanogramových vzorků a single-cell studií.
• Standardizované workflow pro vysokou propustnost (24–72 vzorků/den) s vysokou využitelností MS.
• Možnost integrace do rutinních laboratoří bez nutnosti speciálních nano-LC úprav.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na multiplexní kvantifikaci (např. TMT), automatizaci přípravy a nahrávání vzorků, dálkové monitorování výkonu a rozšíření ultra-nízkých nano-flow přístupů do klinické a průmyslové analýzy stopových proteinů. Inovace v oblasti ionizačních zdrojů a gradientních profilů povede k dalšímu zvyšování citlivosti a reprodukovatelnosti.

Závěr

Vanquish Neo UHPLC v kombinaci s Orbitrap Exploris 480 při průtocích 50–80 nL/min a kolonách 20–30 µm umožňuje vysoce citlivou a současně rychlou analýzu omezených vzorků. Past-and-elute workflow nabízí nejlepší poměr citlivosti, propustnosti a špičkového využití MS pro proteomické aplikace vyžadující maximální výkon.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC.
• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer.
• Double nanoViper™ PepMap Neo kolony (20 µm × 150 mm, 2 µm).
• Single nanoViper™ PepMap Neo kolony (20 µm × 250 mm, 2 µm) a trap kolona (30 µm × 2 mm, 3 µm).
• Proteome Discoverer 2.5 se Sequest HT a INFERYS.