Balancing sensitivity and throughput in single-cell proteomics using low-nanoflow LC-MS

Význam tématu

Analýza proteomů na úrovni jednotlivých buněk a ultra-malokvantitativní vzorky (sub-ng) je klíčová pro pochopení buněčné heterogenity, vývoj nových biomarkerů a pokročilé farmaceutické aplikace. Nano-flow LC-MS při proudech ≤300 nL/min výrazně zvyšuje ionizační efektivitu a citlivost, což umožňuje detailní proteomické studie i při extrémně nízkých hmotnostech vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout sedm vysoce propustných nanoLC-MS metod pro label-free kvantifikaci (LFQ) při omezeném množství vzorků, včetně jednotlivých buněk. Srovnávalo se několik akvizičních strategií (DDA, WW-DDA, DIA) a workflow trap-and-elute (T&E) pro optimalizaci poměru throughput vs. hloubka proteomického pokrytí. Metody byly testovány na HeLa digestu (60 pg–5 ng) a single-cell preparátech HeLa a K562, jak label-free, tak multiplexovaně (TMTpro).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Thermo Scientific Pierce HeLa Digest/PRTC (1 ng/µL, 0.5 fmol/µL PRTC), objemové dávky 0.25–10 µL; single-cell workflow v 384-jamkové destičce (one-pot, label-free); TMTpro 18-plex a 35-plex značkování.

Instrumentace:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo, nano-flow (100 nL/min), kolona Acclaim PepMap 100 C18 (50 µm×15 cm), trap kolona 300 µm×5 mm (backward flush), emitér 10 µm×5 cm.
• Mass spektrometry: Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Astral MS s FAIMS Pro rozhraním.
• Akviziční režimy: DDA, WW-DDA, DIA; rychlost skanu MS1 (120 k) a MS2 (6–30 k), IT 22–54 ms.
• Software: Proteome Discoverer 2.5 (SEQUEST HT, INFERYS), Proteome Discoverer 3.0 (CHIMERYS), Spectronaut 17 (SN17), FDR <1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Direct injection (DI) a T&E workflow dosáhly 72–120 vzorků/den (SPD) s cykly 7–14,4 min.
• DI 20 min metoda identifikovala z 250 pg HeLa digestu >900 proteinových skupin (DDA+SEQUEST+INFERYS), >1 800 (DDA+CHIMERYS) a >2 600 (DIA+SN17).
• T&E 10 min gradient umožnil při 100 SPD identifikovat >2 200 proteinových skupin z 250 pg a >1 100 z 60 pg.
• Orbitrap Astral MS rozšířil pokrytí na >5 000 proteinů z 250 pg při 100 SPD.
• Label-free single-cell DIA T&E (100 SPD) poskytla >1 200 proteinových ID na QC vzorku a ~1 700 proteinů na jednotlivé HeLa buňce.
• TMTpro 18-plex multiplex zvýšil propustnost na ~800 buněk/den s >1 100 proteinovými ID; 35-plex nabízí až ~1 632 buněk/den.

Přínosy a praktické využití metody

Metody kombinují vysokou citlivost i pro sub-ng a single-cell vzorky s rychlou analýzou:

• Ultra-malokvantitativní analýzy pro biologický výzkum, farmaci i klinickou diagnostiku.
• Zkrácené doby přípravy a analýzy (<5,4 min příprava), vyšší propustnost laboratoří.
• Flexibilita workflow (DI vs T&E) dle požadavku na citlivost a throughput.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace, vylepšení ionizačního rozhraní a integrace strojového učení:

• AI‐řízené optimalizace akvizičních parametrů a datové analýzy.
• Rozšíření multiplexních metod (TMTpro 35-plex a více) pro ultra-vysokou propustnost single-cell studií.
• Standardizované workflow pro rutinní klinické proteomické aplikace.
• Pokrývání širšího dynamického rozsahu s vyšší reprodukovatelností.

Závěr

Vyvinuté nanoLC-MS platformy dosahují ideální rovnováhy mezi citlivostí a throughput, umožňují analýzu vzorků od single-cell až po nízké pikogramové koncentrace. Volitelné DDA, WW-DDA či DIA režimy s DI a T&E workflow poskytují univerzální řešení pro výzkumné i průmyslové proteomické studie. Orbitrap Astral MS dále posouvá hranice proteomického pokrytí a otevírá nové možnosti detailního profilování proteomů.

Reference

1. Matzinger M., et al. Anal. Chem. 2023, 95(9):4435–4445.
2. Stejskal K., et al. Anal. Chem. 2021, 93(25):8704–8710.
3. Zheng R., et al. Anal. Chem. 2023, 95(51):18673–18678.