A high-sensitivity high-throughput LCMS platform for single-cell proteomics and low sample amount analysis

Význam tématu

Analýza jednotlivých buněk a velmi malých množství proteinových vzorků vyžaduje špičkovou citlivost a zároveň vysokou propustnost měření. Moderní nano‐LC‐MS platformy umožňují studium buněčné heterogenity a signálních drah na úrovni jednotlivých buněk, což je klíčové pro biologický výzkum i klinická nasazení.

Cíle a přehled studie

Autoři se zaměřili na vývoj nano‐LCMS workflow kombinující extrémně nízký průtok, vysokou citlivost a vysokou denní propustnost. Konkrétní cíle studie:

• Optimalizovat LC metody pro průtok vzorků 24–72 vzorků/den.
• Dosáhnout identifikace stovek až tisíců proteinových skupin z subnanogramových HeLa vzorků.
• Porovnat režimy data‐dependent acquisition (DDA) a data‐independent acquisition (DIA).

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a analýzu byly využity:

• UHPLC systém Thermo Fisher Vanquish Neo s ultra‐nízkým průtokem (100 nL/min).
• 50 μm I.D. × 15 cm Acclaim PepMap C18 kolona (2 μm částice, 1500 bar).
• 10 μm I.D. nanoemitor pro efektivní ionizaci.
• Orbitrap Exploris 480 MS se zařízeními FAIMS Pro.
• DDA režimy zpracované SEQUEST HT s INFERYS a CHIMERYS dekonvolucí spekter, DIA analýza pomocí Spectronaut 16 a DIA‐NN.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo vyvinuto pět nano‐LCMS metod s denní propustností 24, 36, 40, 60 a 72 vzorků a využitelností MS mezi 55 a 85 %. V DDA režimu se podařilo z 0,25 ng HeLa digestu ve 10min gradientu identifikovat cca 800 proteinových skupin. Díky AI‐řízení dekonvoluce spekter CHIMERYS se zvýšila identifikace o 80 %. V DIA režimu s DIA‐NN bylo dosaženo v průměru více než 2000 proteinových skupin z 0,25 ng vzorku. Optimalizace skenovací rychlosti ukázala, že delší akumulace iontů přináší vyšší počet PSM než pouhá rychlost skenování.

Přínosy a praktické využití metody

Tato platforma nabízí:

• Vysokou propustnost až 72 vzorků/den pro velké kohorty.
• Reprodukovatelné separace s nízkou variabilitou retenčních časů a kvantifikace.
• Možnost aplikace pro bezoznačkovou LFQ i TMT značení v single‐cell proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj multiplexních strategií, pokročilých AI algoritmů pro dekonvoluci spekter a integrace s mikrofluidními systémy pro automatizaci přípravy jednotlivých buněk. Kombinace s novými iontovými mobilitními technikami může dále zvýšit proteomickou hloubku a specifičnost.

Závěr

Vyvinutá nano‐LCMS platforma vyniká extrémní citlivostí a vysokou propustností, umožňuje rutinní analýzu subnanogramových vzorků a přináší bezprecedentní proteomickou pokrytí v DDA i DIA režimech. Metoda je vhodná pro large‐scale studie single‐cell proteomiky a analýzu velmi omezených vzorků.

Reference

1. R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.
2. Stejskal K., Op de Beeck J., et al. (2021). Ultrasensitive NanoLC‐MS of Subnanogram Protein Samples Using Second Generation Micropillar Array LC Technology with Orbitrap Exploris 480 MS and FAIMS Pro Interface. Analytical Chemistry, 93(25):8704–8710.