In-Depth Versatile Characterization of Aspartic Acid Isomers via a Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry (cIMS)

Význam tématu

Proteinová izomerizace, zejména přeměna z residue kyseliny asparagové (Asp) na isoasparagovou (isoAsp), může výrazně ovlivnit biologickou aktivitu, stabilitu a bezpečnost bioterapeutik. Vysoce citlivé a selektivní analytické metody pro rozlišení těchto isomerů jsou proto nezbytné při vývoji a kontrole kvality biologických léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat schopnost cyklické iontové mobilní spektrometrie (cIMS) ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) rozlišit a charakterizovat isomery Asp a isoAsp v peptidových modelech relevantních pro bioterapeutika. Studie prezentuje separaci isobarických izomerů beta-amyloidu 1–16 a tryptického peptidu z části těžkého řetězce monoklonální protilátky trastuzumabu (TmAb HC T12).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: syntetické peptidy beta-amyloid 1–16 a TmAb HC T12 obsahující Asp/isoAsp (0,5 µM v 10 mM acetátu amonného); redukovaný, alkylovaný a trypticky štěpený TmAb.
• Chromatografie: ACQUITY H-Class LC pro oddělení tryptických štěpků.
• cIMS systém: SELECT SERIES Cyclic IMS pro vícenásobné průchody a iontovou mobilitu s možností „slicing“ a opětovné injekce pro IMSn.
• Detekce: HDMSE (DIA s iontovou mobilitou) a cílené HDMS/MS (CID, ECD).
  

Hlavní výsledky a diskuse

• Single-pass IMS nedokázalo rozlišit Asp/isoAsp izomery, zatímco po 15–20 průchodech cIMS byla dosažena baseline separace.
• Metoda „slicing“ umožnila selekci iónů po první separaci, jejich opětovné vložení a generování fragmentů (IMSn), čímž se odhalila odlišná konformace peptidových fragmentů b7 a y10 pro Asp vs isoAsp.
• ECD fragmentace následovaná IMS ukázala rozdíly v driftovém čase a m/z pro štěpné ionty, což potvrdilo lokalizaci izomerizace na sedmém zbytku.
• Online LC–HDMSE a cílené HDMS/MS poskytly komplementární informaci pro analýzu TmAb digestu a srovnání s referenčními stanovami.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a citlivost rozlišení isobarických peptidových izomerů.
• Možnost lokalizovat místo izomerizace přímo na úrovni fragmentů.
• Aplikovatelnost pro kontrolu kvality a stability bioterapeutik, kde izomerizace může ovlivnit účinnost a imunogenicitu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování výzkumu bude zahrnovat rozšíření metody na komplexnější proteomické vzorky, optimalizaci počtu průchodů cIMS pro rychlé analýzy a integraci s dalšími technikami (např. top-down MS) za účelem detailního zkoumání posttranslačních modifikací.

Závěr

Cyklická iontová mobilní spektrometrie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií prokázala vysokou univerzálnost při separaci a charakterizaci Asp vs isoAsp isomerů v peptidových modelech. Metoda nabízí novou úroveň rozlišení konformačních rozdílů a umožňuje cílenou IMSn fragmentaci pro přesné lokalizace izomerizace.

Reference

• Zheng, X; Chem Commun (Camb). 2017. 53(56):7913–7916.
• Yang, H; J Proteome Res. 2009. 8(10):4615–4621.