Quantitative LC/MS/MS Analysis of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate Using a Charged Surface-C18 Column

Význam tématu

Monitoring konzumace alkoholu je klíčový v klinickém výzkumu, forenzní toxikologii i kontrole kvality v průmyslu. Metabolity ethyl glucuronide (EtG) a ethyl sulfate (EtS) slouží jako spolehlivé biomarkery pro detekci alkoholu po jeho eliminaci z těla, přičemž poskytují širší detekční okno než samotný alkohol.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní kvantitativní metodu LC/MS/MS pro současné stanovení EtG a EtS v moči. Metoda využívá Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 kolonu na systému Agilent 1290 Infinity II LC spojeném s triple kvadrupólovými detektory Agilent 6470 a Ultivo.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie Agilent 1290 Infinity II (binary pump, multisampler, kolonová termostatická jednotka)
• Kolona: Agilent Poroshell 120 CS-C18 2,1 × 50 mm a 2,1 × 100 mm, 2,7 μm
• Detektory: Agilent 6470 a Ultivo LC/TQ s Jet Stream ESI v negativním módu
• Software: MassHunter Acquisition a MassHunter Quantitative/Qualitative Analysis (verze B.09.00)

Použitá metodika

Analýza probíhala technikou „dilute and shoot“. Vzorky moči byly naředěny 1:50 0,01% formiové kyselině ve vodě a doplněny izotopově značenými interními standardy (EtG-d5, EtS-d5). Chromatografické podmínky zahrnovaly gradient od 2 % methanolu do 98 % v čase 3 min, průtok 0,35 ml/min a kolonu temperovanou na 40 °C. MRM sledování s tranzicemi 221→75/85 (EtG) a 125→97/80 (EtS) zajišťovalo selektivitu a citlivost.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrační křivky byly lineární v rozsahu 100–10 000 ng/ml pro EtG (R² = 0,9990) a 10–1 000 ng/ml pro EtS (R² = 0,9991).
• Studie naředění a objemu injekce ukázala, že 1:50 ředění a 2 μl injekčního objemu poskytují nejlepší tvar píku a citlivost.
• Reprodukovatelnost byla potvrzena více než 1 000 následnými injekcemi s minimální odchylkou ploch a stabilní retencí během 800 cyklů.
• Metoda zajišťuje dobré rozlišení, symetrii píku a stabilní retenční časy (k' > 1,5 pro oba analyty).

Přínosy a praktické využití metody

Systém umožňuje rychlou a jednoduchou přípravu vzorků bez náročné extrakce, což zvyšuje propustnost a snižuje náklady. Metoda je vhodná pro rutinní toxikologická vyšetření, klinický monitoring pacientů, dopingovou kontrolu i průmyslové QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další konjugované metabolity alkoholu či drog.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s vysokopropustnými platformami.
• Adaptace na jiné biologické matrixy (plasma, sérum, vlasy).
• Využití pokročilých datových analýz a strojového učení pro prediktivní toxikologii.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda pro stanovení EtG a EtS v moči prokázala vysokou linearitu, přesnost i reprodukovatelnost. Nasazení Agilent InfinityLab Poroshell CS-C18 kolony a triple kvadrupólu přináší spolehlivé výsledky pro široké spektrum aplikací.

Reference

Agilent Technologies. Quantitative LC/MS/MS Analysis of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate Using a Charged Surface-C18 Column. Application Note, RA44669.5302893519, April 15, 2022.