Ultra-Fast Capillary-Flow LC-MS Profiling of Complex Biological Matrices: Applicable to Large Sample Cohorts

Význam tématu

Analytická charakterizace složitých biologických vzorků, zejména krevní plazmy, je klíčová pro klinický výzkum a personalizovanou medicínu. Tradiční nanoLC-MS nabízí vysokou hloubku proteomu, avšak za cenu nízké průchodnosti a omezené robustnosti. Ultra-rychlá kapilární LC-MS metoda představuje rovnováhu mezi citlivostí, rychlostí a spolehlivostí, potřebnou pro analýzu velkých kohort.

Cíle a přehled studie

Studie představuje sadu pěti optimalizovaných low-flow LC-MS metod na systému Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano v kombinaci s Q Exactive HF-X, které umožňují throughput 180 až 24 vzorků za 24 hodin a využití MS od 75 do 90 %. Metody byly validovány na HeLa proteinu a na syrové plazmě pro ověření opakovatelnosti, hloubky pokrytí a kvantitativní spolehlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol zahrnuje:

• Předkoncentraci vzorku na trap kazetě (RSLCnano pre-concentration kit P/N 6720.0310).
• Kolonu EASY-Spray 75 µm × 150 mm, 3 µm (P/N ES800) připojenou k RSLCnano systému.
• Gradientní eluci při průtocích 0,3 až 1,5 µL/min a délkách analýzy 8, 14.4, 24, 48, 60 min.
• Vysokorychlé vstřikování autosamplerem, nezávislé mytí trapu a analytické kolony.
• Hmotnostní spektrometr Q Exactive HF-X s EASY-Spray zdrojem v režimu Full MS a DDA.
• Software Xcalibur pro akvizici dat a Proteome Discoverer pro zpracování s FDR < 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované metody poskytují ostré a symetrické chromatografické píky (PWHM 3 s při 8 min až 10 s při 60 min), retenční časy s SD < 0,1 min a průměrnou asymetrii 1,15. MS/MS selekce dosahuje konverze 40–60 % do PSM. Identifikace proteomů:

• HeLa digest: > 1000 proteinových skupin při 8 min, 3400 skupin při 60 min.
• Surová plazma: 150 proteinových skupin v 8 min, nad 250 skupin a 2700 peptidových skupin v 60 min.

Kvantitativní opakovatelnost potvrdilo více než 200 iterativních injekcí během < 3 dní bez úbytku citlivosti. V 14,4 min metodě bylo 90 % proteinů kvantifikováno s CV < 20 % a dynamický rozsah činil 5 řádů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Vysoce průchodné analýzy velkých souborů vzorků (klinické studie, screening).
• Minimální carry-over a robustní provoz bez nutnosti častých údržeb.
• Automatizované zpracování vzorků bez redukce/alkylace.
• Bohaté proteomické pokrytí a kvantitativní spolehlivost v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje:

• Integrace s automatizovanými platformami pro přípravu vzorků a vysokoprůchodné robotické systémy.
• Rozšíření použití na další biologické matrice (buňky, tkáně, utl.
• Adaptace na cílené MRM/SRM aplikace pro klinickou diagnostiku.
• Využití strojového učení pro optimalizaci gradientů a interpretaci dat v reálném čase.

Závěr

Představené ultra-rychlé kapilární LC-MS metody kombinují vysokou průchodnost, robustnost a hloubku proteomického pokrytí. Bez nutnosti rozsáhlé údržby či kompromisu v citlivosti poskytují spolehlivý nástroj pro analýzu rozsáhlých biologických kohort.

Reference

1. RSLCnano pre-concentration nano LC kit, Ultimate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide, Thermo Fisher Scientific.
2. Boychenko A., Pynn C., van den Berg B. et al. High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization. TN 72227, Thermo Fisher Scientific.
3. Boychenko A., Meding S., Decrop W., Ruehl R., Swart R. Capillary-flow LC-MS: combining high sensitivity, robustness, and throughput. TN 72277, Thermo Fisher Scientific.