Tailored high-throughput low-flow LC-MS methods for large sample cohort analysis

Význam tématu

Metody kapilárního low-flow LC–MS umožňují spojit vysoké chromatografické rozlišení s dostatečnou robustností a citlivostí pro analýzu krevních biofluidů. Díky nižším průtokům se maximálně využívá kapacita MS detekce a zvyšuje se počet vzorků analyzovatelných za den, což je zásadní pro rozsáhlé klinické kohorty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo navrhnout a ověřit pět low-flow LC–MS postupů s délkou analýzy od 8 do 60 minut a průtoky 0,3–1,5 µL/min. Tyto metody nabízejí průtok až 180 vzorků/den při využití běžné konfigurace Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano bez změny hardwaru či fluidiky, pouze výměnou kolony.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (HeLa digest, sérum) byly připraveny srážením metanolem, jednoduchou enzimatickou digescí bez redukce/alkylace a čištěním na SPE HyperSep C18. Chromatografie probíhala na UltiMate 3000 RSLCnano s EASY-Spray C18 kolónou (15 cm, 3 µm) při teplotě 60 °C a průtocích 0,3–1,5 µL/min. MS data byly získány na Orbitrap Exploris 480 nebo Q Exactive HF-X pomocí DDA (MS1 rozlišení 120 000, MS2 režim TOP20/TOP40).

Hlavní výsledky a diskuse

Tajemné metody prokázaly lineární nárůst identifikací s délkou běhu: 8minutová metoda poskytla ~5947 peptidů a 1123 proteinů, 60minutová až 26968 peptidů a 3023 proteinů z 200 ng HeLa digestu. MS využití dosáhlo 75–95 % a průměrná šířka PWHM kolísala 3–10 s. Robustnost ověřili opakovanými analýzami >200 vzorků séra bez degradace výkonu a minimálním carry-over.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá adaptace hloubky proteomické analýzy bez úprav systému.
• Vysoká propustnost až 180 vzorků/den pro rozsáhlé klinické studie.
• Dynamický rozsah kvantifikace až 5 dekád koncentrace.
• Vysoká stabilita a nízké carry-over i pro složité biofluidní matice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizovaná příprava vzorků s integrací low-flow LC–MS.
• Rozšíření na další biofluidy a tkáňové extrakty.
• Algoritmická optimalizace gradientů a akvizice pomocí strojového učení.
• Kombinace s iontovou mobilitou pro zvýšenou selektivitu a proteomovou hloubku.

Závěr

Navržené low-flow LC–MS metody zajišťují efektivní kompromis mezi propustností, proteomickou hloubkou a robustností bez potřeby úprav hardwaru. Nabízejí škálovatelný přístup pro velké klinické kohortní studie s vysokou analytickou spolehlivostí.

Reference

• Boychenko A, Pynn C, van den Berg B, Arrey TN, Baynham M, Decrop W, Ruehl M. High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN72777; 2019.
• Thermo Fisher Scientific. UltiMate 3000 RSLCnano System – Versatility and Performance – The Ultimate Solution for All Separation Workflows. Technical Bulletin BR-71898; 2016.
• Thermo Fisher Scientific. Comprehensive and versatile low-flow UHPLC system for routine and advanced LC-MS applications. Product Specifications PS-71899.
• Thermo Fisher Scientific. UltiMate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide. Document No. 4820.4103.