Large Scale Targeted Protein Quantification Using HR/AM Selected Ion Monitoring with MS/MS Confirmation on a Novel Hybrid, Q-OT-qIT Mass Spectrometer

Význam tématu

Proteomika se stále více zaměřuje na kvantitativní analýzu proteinů, aby bylo možné lépe porozumět jejich funkcím, interakcím a změnám v biologických systémech. Vzhledem k vysoké komplexitě a dynamickému rozsahu proteinových vzorků vyžadují tradiční závislé metody (DDA) velmi rychlou akvizici MS/MS a často selhávají v dosažení dostatečné reprodukovatelnosti a citlivosti u nízkokoncentrovaných proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout datově nezávislý (DIA) workflow pro velkoobjemovou cílenou kvantifikaci proteinů na novém hmotnostním spektrometru Orbitrap Fusion Tribrid. Metoda kombinuje paralelní snímání vysoce rozlišovacího a přesnoměrného (HR/AM) SIM a rychlé kolizní indukované fragmentace (CID) ve lineárním iontovém pasti pro současnou kvantifikaci a potvrzení sekvence peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro oddělení a ionizaci vzorků byla použita nano-LC soustava EASY-nLC 1000 s kolonkou PepMap C18 (2 µm, 75 µm × 50 cm). Analytická část probíhala na Orbitrap Fusion Tribrid MS s EASY-Spray zdrojem:

• HR/AM SIM: rozlišení 240 000 FWHM, šířka izolačního okna 200 amu, AGC target 2×10⁴
• CID MS/MS: 17 po sobě jdoucích skenů, izolace 12 amu, AGC target 1×10⁴

Data byly zpracovány v softwaru Pinpoint 1.3, který využívá spektrální knihovnu pro kvalifikaci fragmentů (b a y iontů) a extrakci iontových chromatogramů s tolerancí ±5 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost a selektivitu:

• Mezní detekční koncentrace 10 attomol na kolonu pro isotopově značené standardy v matici E. coli digestu
• Čtyři řády lineárního dynamického rozsahu s koeficientem determinace R² >0,99
• Reprodukovatelnost kvantifikace: více než 90 % peptidů mělo %CV <10 %
• Ve stejných datech bylo cíleně kvantifikováno 172 proteinů E. coli (771 peptidů) s více než 70 % peptidů s %CV <10 %

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou citlivost pro detekci nízkokoncentrovaných proteinů v komplexní matrici
• Kompletní a reprodukovatelnou kvantifikaci bez selektivního vynechání vzorkových komponent
• Současné potvrzení sekvence zpečetěné spektrální knihovnou
• Vhodnost pro rozsáhlé studie QA/QC, biologického výzkumu i klinické proteomiky

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Automatizované zpracování velkých datových objemů pomocí strojového učení a umělé inteligence
• Rozšíření workflow na neznámé proteomy a biomarkery
• Integrace s dalšími omickými technologiemi pro systémovou biologii
• Klinické aplikace ve farmacii a personalizované medicíně

Závěr

Nový DIA přístup na Orbitrap Fusion Tribrid umožňuje vysoce citlivou a selektivní kvantifikaci proteinů s potvrzením sekvence v jednom instrumentálním běhu. Metoda dosahuje nízkonivových detekčních limitů, širokého dynamického rozsahu a vynikající reprodukovatelnosti, což ji činí silným nástrojem pro cílenou proteomiku.

Reference

1. Gillet L.C., Navarro P., Tate S. et al. Targeted data extraction of MS/MS spectra generated by DIA: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics, 2012.
2. Egertson J.D., Kuehn A., Merrihew G. et al. Multiplexed Data Independent Acquisition for Comparative Proteomics. ASMS poster, 2012.
3. Gallien S., Duriez E., Demeure K., Domon B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: implication for proteomics experiments. Journal of Proteomics, 2013.