Large Scale Targeted Protein Quantification using HR/AM Selected Ion Monitoring with MS/MS Confirmation on the Orbitrap Fusion Tribrid MS

Význam tématu

V oblasti proteomické analýzy je klíčové dosáhnout vysoké citlivosti, selektivity a širokého dynamického rozsahu při kvantifikaci cílených proteinů v komplexních biologických matricích. Metody s data independent acquisition (DIA) slibují lepší opakovatelnost a úplnost kvantitativních dat oproti tradičním přístupům založeným na data dependent acquisition (DDA). Kombinace vysoce přesného rozlišení (HR/AM) ve vybraném iontovém monitorování (SIM) s paralelními rychlými MS/MS záznamy na platformě Orbitrap Fusion Tribrid MS otevírá nové možnosti pro kvantifikaci nízkootáčkových i vysoce obsažených proteinů v jediné analýze.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a ověřit novou pracovní metodiku DIA založenou na simultánním sběru tří SIM skenů s vysokým rozlišením a paralelních 17 sekvenčních CID MS/MS skenů pro potvrzení sekvence. Metoda byla validována na standardních vzorcích obsahujících isotopově značené peptidy a komplexní proteomické směsi z E. coli či BSA. Zkoumaly se detekční limity, linearita, selektivita a přesnost v rámci pěti dekád dynamického rozsahu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byl použit Nano-LC systém EASY-nLC 1000 se sloupcem PepMap C18 (75 μm x 50 cm, 2 μm) a gradientem 5–35 % acetonitrilu během 120 minut při průtoku 300 nL/min. Orbitrap Fusion Tribrid MS pracoval s VP kapilárou (275 °C, 1,8 kV). Hlavní parametry:

• FT-SIM: rozlišení 240 000 FWHM, AGC target 2E4, izolační okno 200 amu
• Lineární iontový past: 17 CID MS/MS (12 amu); AGC target 1E4, rychlá detekce v trapu
• Oblast sběru tří SIM oken: 400–600, 600–800, 800–1000 m/z
• Spektrální knihovna a software Thermo Scientific Pinpoint v1.3 pro extrakci XIC (5 ppm) a potvrzení osmi nejintenzivnějších fragmentů

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla detekčního limitu 10 amol na sloupec pro jednotlivé peptidy ve vzorku E. coli s lineární dynamikou v rozsahu čtyř dekád. Při analýze směsi šesti bovinních proteinů spikovaných v E. coli matrice bylo možné kvantifikovat proteiny v rozsahu 10 amol až 1 pmol s koeficienty variace (%CV) nižšími než 10 % u 90 % peptidů.
Navíc stejná datová sada v jediném běhu umožnila přesné měření 771 peptidů reprezentujících 172 E. coli metabolických proteinů (69 % peptidů s %CV < 10 %, 88 % s %CV < 15 %). Vysoké rozlišení SIM signifikantně potlačilo rušivé signály z pozadí a kapacitní obohacení iontů zlepšilo citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

Nový DIA workflow nabízí:

• Jednorázové kvantifikace i pro rozsáhlé cílené proteomické projekty
• Vysokou selektivitu díky rozlišení 240 000 pro oddělení interferujících iontů
• Široký dynamický rozsah a nízké LOD pro analýzu nízkoabundantních proteinů
• Současné potvrzení sekvence peptidů záznamem CID MS/MS

Metoda je vhodná pro biologický výzkum, QA/QC v biotechnologiích a klinické aplikace vyžadující přesné a citlivé stanovení proteinových biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření DIA přístupů integrovaných s metody multiplexního značení (TMT, iTRAQ) pro paralelní srovnání více vzorků. Dále je slibná kombinace s vysokorychlostními chromatografiemi a automatizovanými workflow pro nasazení v klinických laboratořích. Vývoj umělé inteligence pro pokročilou extrakci signálu by mohl zvýšit citlivost a rychlost zpracování dat.

Závěr

Popsaný HR/AM SIM+DIA workflow na Orbitrap Fusion přináší vysoce citlivou, selektivní a reprodukovatelnou kvantifikaci cílených proteinů v komplexních vzorcích. Metoda prokázala nízké detekční limity, široký dynamický rozsah a vynikající přesnost v jediném experimentu, což ji řadí mezi špičkové nástroje pro proteomická kvantifikaci.

Reference

1. Gillet LC et al. Mol Cell Proteomics. 2012;11:O111.016717.
2. Egertson JD et al. Multiplexed Data Independent Acquisition for Comparative Proteomics. ASMS poster; 2012.
3. Gallien S et al. J Proteomics. 2012;81:148–158.