Targeted Quantitative Proteomics

Význam tématu

Zařízení pro cílenou kvantifikaci proteomů umožňují přesné stanovení konkrétních proteinů v komplexních biologických maticích. Tato analýza hraje klíčovou roli při verifikaci biomarkerů, studiu signálních drah či kontrole kvality v biomedicínském výzkumu a průmyslové analytice. Použití vysoce selektivní a citlivé metody zajišťuje spolehlivé výsledky i při nízkých koncentracích cílových peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného materiálu je demonstrovat výhody použití vysokého rozlišení a přesné hmotnostní analýzy (HR/AM) při cílené proteomice. Studie představuje platformu Thermo Scientific Q Exactive, popisuje tři hlavní metodiky (PRM, SIM, DIA) a jejich multiplexní varianty (msxSIM, msxDIA), a porovnává je s tradičním SRM na triplekvadrupólu.

Použitá metodika

1. PRM (Parallel Reaction Monitoring): selektivní izolace a fragmentace prekurzorů s následnou analýzou produktových iontů v Orbitrapu, zaručující vysokou selektivitu a citlivost.
2. SIM (Selected-Ion Monitoring): detekce vybraných prekurzorových iontů bez fragmentace, umožňuje 5–50× vyšší citlivost oproti full-scan režimu.
3. DIA (Data-Independent Acquisition): nepřerušované získávání dat MS/MS přes široké izolační okno, poskytuje vysoké pokrytí proteomu a robustní kvantifikaci.
4. Multiplexní varianty (msxSIM, msxDIA): paralelní sledování více oken či iontů v jednom skenu pro zvýšení průchodnosti a selektivity.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Q Exactive hybridní kvadrupól-Orbitrap MS (rozlišení až 140 000, přesnost <1 ppm, rychlost až 12 HCD scanů/s).
• Dionex UltiMate 3000 RSLCnano a EASY-nLC 1000 UHPLC systémy.
• EASY-Spray nano-ESI zdroj s nanoViper konektory.
• Přípravné sady: Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture, HeavyPeptide Standardy, IGNIS Prime Kit.
• Software Pinpoint pro tvorbu metod, budování spektrálních knihoven a automatizované zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• PRM dosahuje selektivity a citlivosti na úrovni attomolů, eliminuje rušivé signály.
• SIM zvyšuje citlivost 5–50× oproti celoskeneru a je vhodný pro labile peptidy.
• DIA poskytuje rozsáhlé a reprodukovatelné pokrytí proteomu, s mírně nižší citlivostí.
• Multiplexní režimy msxSIM a msxDIA významně zlepšují průchodnost analýz a potlačují interferenci.
• Pinpoint zrychluje vývoj metod a umožňuje retrospektivní dolování dat.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoce selektivní HR/AM kvantifikace nachází uplatnění při validaci biomarkerů, monitorování signálních drah, QA/QC protokolech v biotechnologiích a farmaceutickém vývoji. Flexibilita metod umožňuje cílení na libovolné peptidy bez nutnosti náročného výběru přechodů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Kombinace multiplexace s umělou inteligencí pro optimalizaci metod v reálném čase.
• Rozšiřování retrospektivního dolování dat a strojového učení pro objev nových biomarkerů.
• Integrace HR/AM technologií do klinické rutiny a personalizované medicíny.
• Vývoj robustních standardů a kalibrací pro srovnatelnost mezi laboratořemi.

Závěr

Metody HR/AM mass spectrometrie PRM, SIM a DIA spolu s jejich multiplexními variantami nabízejí univerzální, vysoce selektivní a produktivní přístupy k cílené proteomické kvantifikaci. Významně překonávají tradiční SRM v citlivosti i flexibilitě a otevírají nové možnosti pro komplexní biologické aplikace.

Reference

1. Peterson A.C. et al. Parallel Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative, Targeted Proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012.
2. Gallien S. et al. Targeted Proteomic Quantification on Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics, 2012.
3. Gillet L.C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data independent acquisition. Mol Cell Proteomics, 2012.
4. Egertson J.D. et al. Multiplexed Data Independent Acquisition for Comparative Proteomics. ASMS poster, 2012.
5. MacLean B. et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics, 2010.