Large-Scale Targeted Protein Quantification Using WiSIM-DIA on an Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Proteomika se posouvá od pouhé identifikace proteinů k přesné kvantifikaci jejich abundancí v komplexních biologických vzorcích. Pro detailní pochopení funkcí proteinů a ověřování biomarkerů je nezbytné dosáhnout vysoké citlivosti, selektivity a reprodukovatelnosti dat, což tradiční závislé metody akvizice často omezuje.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a vyhodnotit workflow nazvané WiSIM DIA (wide selected-ion monitoring data-independent acquisition) na Orbitrap Fusion Tribrid masovém spektrometru pro rozsáhlou cílenou kvantifikaci proteinů s extrémně nízkými detekčními limity a širokým dynamickým rozsahem.

Použitá metodika a instrumentace

• Orbitrap Fusion Tribrid MS se sekvenčním kvadrupólem, Orbitrap detektorem (resoluce 240 000 při m/z 200) a lineární iontovou pastí pro CID MS/MS.
• SIM akvizice s širokými izolacemi 200 m/z pro cílenou obohacení prekurzorů v rozsahu m/z 400–1000.
• Paralelní sběr 17 CID MS/MS spektrogramů s izolací 12 m/z v lineárním iontovém trapu pro sekvenační potvrzení.
• Nano-LC systém EASY-nLC 1000 s EASY-Spray PepMap C18 kolonu (75 μm×50 cm, částice 2 μm) s gradientem 2–32 % acetonitrilu ve 125 minutách.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční limit 10 attomol na kolonu při zachování vysoké selektivity díky HRAM SIM datům.
• Lineární dynamický rozsah čtyři dekády s koeficienty variace CV <15 % pro většinu peptide.
• Srovnání SIM versus full scan ukazuje až pětinásobné zvýšení poměru signál/šum.
• Kvantifikace a potvrzení identity více než 1000 E coli proteinů v jediném běhu s úspěšností 98 %.
• Reprodukovatelné výsledky s CV <10 % pro 90 % cílených proteinů.

Přínosy a praktické využití

Workflow WiSIM DIA spojuje výhody datově nezávislé akvizice pro komplexní průzkum vzorku s cílenou kvantifikací prekurzorů na úrovni attomolů a zároveň umožňuje spolehlivou sekvenační validaci fragmenty MS/MS. Metoda je vhodná pro velkosítní screening biomarkerů, QA/QC v průmyslu, systémovou biologií i klinické analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spectralních knihoven a automatizovaná generace cílených metod.
• Multiplexní analyty se stabilními izotopy pro simultánní měření více cílových proteinů.
• Integrace WiSIM DIA do klinických a diagnostických protokolů.
• Aplikace na další hybridní spektrometry nové generace a vývoj real­time akvizice.

Závěr

Navržené WiSIM DIA workflow na Orbitrap Fusion Tribrid MS poskytuje vysokou citlivost a selektivitu pro kvantifikaci cílených proteinů v komplexních vzorcích s nízkými LOD, širokým dynamickým rozsahem a vynikající reprodukovatelností. Metoda umožňuje v jednom běhu jak přesná kvantitativní data, tak spolehlivé sekvenační potvrzení.

Reference

• Gillet LC et al Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition a new concept for consistent and accurate proteome analysis Mol Cell Proteomics 2012
• Egertson JD et al Multiplexed MS/MS for improved data-independent acquisition Nature Methods 2013
• Gallien S et al Selectivity of LC-MS/MS analysis Implication for proteomics experiments Journal of Proteomics 2013
• Prakash A et al Expediting the development of targeted SRM assays using data from shotgun proteomics to automate method development J Proteome Research 2009