Quantification of Drug Metabolites in Early-Stage Drug Discovery Testing

Význam tématu

Včasná a přesná kvantifikace farmak metabolitů v raných fázích vývoje léčiv je klíčová pro správné posouzení farmakokinetických vlastností, toxikologických rizik a optimalizaci kandidátních sloučenin. Tradiční UV detekce a MS mohou selhávat u látek s nízkou absorpcí nebo ionizačními problémy. Charged aerosol detection (CAD) s inverzním gradientem přináší jednotnou odpověď pro nevolatilní analyty, což snižuje riziko pod- či nadhodnocení metabolitů.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí použití vysoce účinné UHPLC kolony v kombinaci s Corona ultra RS CAD a porovnává jej s UV detekcí. První část srovnává odezvu standardních látek a jejich metabolitů při 10 µg/mL. Druhá část zkoumá metabolismus klozapinu inkubací s jaterními mikrosomy potkana a porovnává odezvy pre- a post-inkubaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky standardů a inkubátů byly připraveny v acetonitril/voda roztoku a extrahovány acetonitrilem.

• UHPLC systém Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC (DGP-3600RS, WPS-3000TRS, TCC-3000RS, DAD-3000RS)
• Kolona Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18, 2.2 µm, 2.1×250 mm
• Mobilní fáze A: 0.1% kyselina formiová ve vodě, B: 0.1% kyselina formiová v acetonitrilu; průtok 0.75 mL/min; analytický gradient 5–95% B, inverzní gradient 95–5% B
• CAD Corona ultra RS: nebulizér 25 °C, filtr 3, exponent funkce 1.0, divert 0.6–1.1 min
• Mass spectrometry nebylo použito pro tuto evaluaci
• Software Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7.1 SR1

Hlavní výsledky a diskuse

CAD poskytla téměř jednotnou odpověď napříč různými metabolity, s RSD 5.1%, zatímco UV detekce vykazovala RSD až 58% na vlnové délce 210 nm. U acetaminofenu byly tři hlavní metabolity rozlišeny s vysokou reprodukovatelností. U klozapinu byla zachycena degradace API o 21% (79% recovery) a nárůst dvou hlavních metabolitů, což potvrzuje správnost mass balance. CAD detekce zachovala citlivost i pro nízké koncentrace (S/N >14) a byla stabilní při interlaced injekcích (RSD <1.5%).

Přínosy a praktické využití metody

• Universální odezva pro nevolatilní API a metabolity bez nutnosti korekcí podle molekulové hmotnosti
• Zvýšená přesnost kvantifikace v raných fázích vývoje
• Komplementární data k UV a MS detekci pro potvrzení identity a množství analytů
• Rychlé nasazení bez časově náročné optimalizace pro každý vzorek

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace CAD do multi-detekčních platforem v kombinaci s vysokorozlišujícími MS metodami umožní komplexní profilaci metabolitů včetně sledování reaktivních meziproduktů. Další rozvoj inverzních gradientů a zdokonalení nebulizace povede k lepší robustnosti a snížení meziprovozních variací.

Závěr

CAD s inverzním gradientem v UHPLC systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLC představuje spolehlivou a reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci metabolitů v raných fázích vývoje léčiv. Nabízí univerzální odezvu, vysokou citlivost a minimalizuje riziko chybných odhadů koncentrací při neoptimalizovaných podmínkách.

Reference

• Górecki T, Lynen F, Szucs R, Sandra P. Universal Response in Liquid Chromatography Using Charged Aerosol Detection. Anal Chem. 2006;78:3186–3192.
• DeLand P, Waraska J, Crafts C, Acworth I, Steiner F, Fehrenbach T. Improving the Universal Response of Nebulization-Based UHPLC Detection. LC/GC. 2011;April Supplement:45–49.
• Cai H, Crafts C, Ramanathan RR, Humphreys W, Bailey B, Josephs JJ. Novel Detection Technology: Charged Aerosol Detection (CAD) Coupled with HPLC, UV, and LTQ-Orbitrap MS for Semi-Quantitation of Metabolites in Drug Discovery Metabolism Studies. ASMS; 2010.
• Crafts C, Plante M, Bailey B, Malek G, Neely M. Use of Charged Aerosol Detection as an Orthogonal Quantification Technique for Drug Metabolites in Safety Testing (MIST). Eastern Analytical Symposium; 2011.
• Nedderman A. Metabolites in Safety Testing: Metabolite Identification Strategies in Discovery and Development. Biopharm Drug Dispos. 2009;30:153–162.