EAS: Improving the Quantitation of Unknown Impurity Analysis Using Dual-Gradient HPLC with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

Analytické stanovení neznámých nečistot bez dostupnosti čistých referenčních standardů představuje v řadě oborů, zejména farmaceutické výrobě, významnou výzvu. Charged aerosol detection (CAD) umožňuje téměř jednotnou hmotovou odezvu pro všechny nevolatilní složky, avšak gradientní HPLC módy mění složení eluátu a tím i efektivitu nebulizace, což vede k odchylkám v kvantifikaci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ověřit, že kombinace duálního gradientního HPLC/UHPLC s postkolonním inverzním gradientem a CAD detektorem významně zlepší konzistenci odezvy a umožní relativní kvantifikaci neznámých nečistot pomocí jediného kalibrantu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byl využit systém UltiMate 3000 RSLC s duálním gradientem vybavený:

• Kolony Acclaim RSLC 120 C18 (3 µm, 3,0 × 33 mm)
• Diode Array Detector (UV 210 nm a 254 nm)
• Corona ultra Charged Aerosol Detector (dusík 35 psi)

Mobilní fáze tvoří 10 mM acetát amonný (pH 4,5) a acetonitril. Průtok byl nastaven na 1 mL/min u obou gradientních větví (celkem 2 mL/min k detektorům). Inverzní gradient byl realizován přidáním druhého postkolonního toku se složením obráceným vůči primárnímu elucičnímu gradientu.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Při testu pěti běžných léčivých sloučenin se RSD signálu CAD snížilo z ~19 % na 4,4 % po zavedení inverzního gradientu, přičemž citlivost zůstala nezměněna.
2. V druhé sadě devíti vzorků různé povahy (aminokyseliny, NSAID, sulfonáty, steroidy) bylo dosaženo lineárních kalibrací s koeficienty R² ≥ 0,999 v rozsahu 7–230 µg/mL.
3. Recoveries zpětně dopočítané k jediné kalibrační křivce dosahovaly 66 % hodnot do odchylky ±25 % a 87 % do ±50 %; po vyloučení carry-over sloučeniny (dodecylsulfát) se konzistence dále zvýšila.
4. Srovnání s UV detekcí ukázalo výrazně lepší opakovatelnost CAD (23 % RSD) oproti UV210 nm (101 % RSD) a UV254 nm (125 % RSD).
5. Odhad detekčních limitů (LOD) činil 1–5 ng na kolonu a kvantifikačních limitů (LOQ) 6–11 ng.

Přínosy a praktické využití metody

Duální gradientní HPLC s inverzním postkolonním tokem a CAD detekcí umožňuje:

• Relativní kvantifikaci neznámých nečistot pomocí jednoho kalibrantu bez ohledu na optické vlastnosti.
• Vylepšené výpočty hmotové bilance, kontrolu degradantů, monitorování syntézy i validaci čištění zařízení.
• Snížení nákladů a času při vývoji a validaci metod díky jednotné platformě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení CAD v kombinaci s UHPLC pro rutinní screening stopových nečistot, rozšíření pro semivolatilní analyty, vývoj univerzální kalibrace softwaru a integrace s nanoLC a hmotnostní spektrometrií pro ještě vyšší citlivost a selektivitu.

Závěr

Implementace duálního gradientu se stíněným postkolonním tokem CAD na systému UltiMate 3000 RSLC přináší významné zvýšení konzistence signálu a přesnosti kvantifikace neznámých nevolatilních složek. Metoda jednoznačně překonává tradiční HPLC-UV přístupy a nabízí jednoduchou cestu k relatívnímu stanovení stopových nečistot v různých aplikacích.

Reference

1. Dependence of Response on Chemical Structure, ESA—A Dionex Company, Application Brief 70-8913 Rev B.
2. Matthews M. et al., Improving Quantitative Measurements for the ELSD, Chromatographia 2004, 60, 625–633.
3. Lane C. et al., Toward Single Calibrant Quantification in HPLC, Anal. Chem. 2005, 77, 4354–4365.
4. Górecki T., Lynen F., Scucs R., Sandra P., Universal Response in Liquid Chromatography Using Charged Aerosol Detection, Anal. Chem. 2006, 78, 3186–3192.