Early-stage drug metabolite quantitation without radiolabels

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kvantifikace raných metabolitů lékových kandidátů je klíčová pro rozhodování ve vývoji léčiv. Tradiční standard radiolabelingu je časově i finančně náročný; alternativy založené na UV nebo MS bez referenčních standardů mají systematická omezení. Charged Aerosol Detection (CAD) představuje univerzální detekční techniku s téměř strukturálně nezávislou odpovědí, což ji činí velmi vhodnou pro kvantifikaci neznámých nebo dosud nedefinovaných neměnlivých (nonvolatile) metabolitů v raných fázích DMPK studií.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit metodiku pro kvantifikaci klozapinu a jeho metabolitů v lidských jaterních mikrozomech bez použití radiolabelů a bez dostupných referenčních standardů pro jednotlivé metabolity. Metoda kombinuje UHPLC separaci s Vanquish CAD (P series) pro kvantifikaci a s paralelním použitím UV detektoru a ISQ EM hmotnostního spektrometru pro komparaci a identifikaci metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda a příprava vzorků:

• Matrix: lidské jaterní mikrozomy (50-donor pool), inkubace s klozapinem (2 mg/mL ve formě 2 µL přidaného do reakce) v 50 mM NH4HCO3 pH ~7.4 se 20 mM NADPH.
• Objem reakce: přibližně 210 µL (konkrétně 193 µL pufru, 2 µL klozapinu, 5 µL mikrozomů, spuštěno 10 µL NADPH).
• Inkubační časy: 30, 60, 90, 120 a 180 min při 37 °C; optimalizováno na 180 min (RSD clozapinu 4.2%, n=3).
• Post-inkubace: vortex, centrifugace 14 000 rpm 10 min, přenos supernatantu do vialů.

Chromatografie a detekce:

• Kolona: Hypersil GOLD C18, 150 × 2.1 mm, 1.9 µm.
• Mobilní fáze: A = 0.1% kyselina mravenčí ve vodě, B = 0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu; průtok 0.5 mL/min, specifický gradient s IGC (inverse gradient compensation) nastaveným ofsetem ~538.5 µL pro udržení konstantního složení v detektoru.
• Injekční objem: 5 µL; autosampler 6 °C; kolona 30 °C.
• Detekce: Vanquish DAD (více vlnových délek), Vanquish Charged Aerosol Detector HP (CAD P series) a ISQ EM MS pro identifikaci.
• CAD nastavení: teplota odpařovače 25 °C, coupling mode aktivován (nabíjecí-modul ~5 °C nad teplotou odpařovače), čtyři datové kanály s Power Values (PV) 1.5, 1.65, 1.8 a 1.95; diverter valve posílá prvních ~1.6 min do odpadu pro ochranu CAD před solným bohatým matrixem a umožňuje přesměrování do MS v bypass pozici.

MS nastavení:

• ISQ EM s HESI, pozitivní ionizace, dva střídavé Full MS skeny m/z 90–400 a 400–1000, výchozí (easy) metody, total scan time ~0.208 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace a kalibrace:

• Pro CAD byl vybrán PV = 1.5 (legacy PFV = 1.0) na základě analýzy residuí; lineární oblast pokrývala přibližně dvě dekády a lineární fity měly r2 ≥ 0.998 pro všechny čtyři kanály.
• Evaporační teplota CAD 25 °C zlepšila citlivost pro potenciálně semivolatilní metabolity; rozdíl v pozadí mezi 25 °C a 50 °C byl nevýznamný.

Senzitivita a limity:

• LOQ pro CAD stanovena na 0.67 ng/µL (3.4 ng na sloupci) vycházející z nejnižšího kalibračního standardu. Pro DAD při 260 nm byl LOQ vypočten jako 0.09 ng/µL (0.45 ng na sloupci) na základě S/N ≥10.

Kvantifikace a identifikace metabolitů:

• Metabolity byly kvantifikovány CAD bez nutnosti jejich standardů; UV kvantifikace byla prováděna pomocí klozapinu jako jediného kalibrantu, což může vést k nadhodnocení nebo podhodnocení u metabolitů s odlišnou chromoforovou aktivitou.
• Typicky naměřené koncentrace metabolitů se pohybovaly až do 1.52 ng/µL (nejvyšší pozorovaná), některé signály byly pod LOQ.
• MS potvrdil postranní produkty odpovídající N-demethylaci (N-demethylclozapine, m/z ~313.1) a N-oxidaci (clozapine-N-oxide, m/z ~343.1); další oxidační produkt (m/z ~352.1) zůstal neidentifikován bez fragmentačních dat.

Výkonnost a přesnost:

• Celkový recovery (součet ploch) byl 93% pro CAD a 92% pro UV (porovnání 0 vs 180 min), RSDy kalibrace a opakovatelnosti byly přijatelné.
• MS nebyl vhodný pro kvantifikaci bez standardů kvůli variabilní ionizační účinnosti různých metabolitů; sloužil primárně jako nástroj pro identifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje ranou kvantifikaci metabolitů bez radiolabelingu ani individuálních standardů, což zkracuje čas a snižuje náklady v DMPK screenings a metabolických studiích.
• CAD poskytuje homogennější, téměř molekulárně nezávislou odpověď pro nonvolatile a některé semivolatile látky v porovnání s UV a MS, což zjednodušuje stanovení relativního množství neznámých metabolitů.
• Integrovaná diverter valve umožňuje automatickou ochranu CAD před solnými matricemi a současně sběr dat pro MS potvrzení bez přerušení práce uživatele.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širokou škálu API, zejména tam, kde metabolity postrádají silný chromofor nebo jsou obtížně ionizovatelné.
• Využití CAD v kombinaci s MS s pokročilými fragmentačními režimy (MS/MS) by umožnilo přesnější strukturální identifikaci neznámých metabolitů při zachování CAD pro kvantifikaci.
• Zlepšení limitů detekce kalibrací pod úrovní aktuálního LOQ (např. zavedení standardů 0.2–0.3 ng/µL) může ještě rozšířit citlivost pro stopové metabolity.
• Automatizace workflow a integrace s LIMS/CMS pro vysokopropustné DMPK screeningy bez radiolabelingu.

Závěr

Studie potvrzuje, že UHPLC-CAD (Vanquish CAD P series) ve spojení s diverter ventilovým uspořádáním a doplňkovou MS identifikací je vhodnou a praktickou alternativou k radiolabelingu pro rané kvantitativní hodnocení neměnných a semivolatilních metabolitů v jaterních mikrozomech. Metoda dosahuje LOQ ~0.67 ng/µL pro CAD, poskytuje jednotné odpovědi mezi metabolity a zachovává možnost strukturální identifikace pomocí MS. Doporučuje se použití inkubace 180 min, EvapT 25 °C a PV 1.5 pro optimální výkon.

Reference

1. Amatobi K., Lovejoy K. Thermo Fisher Scientific TN003816: Method transfer and optimization of deoxycholic acid analysis using HPLC-CAD, 2025.
2. Cai H.; Crafts C.; Ramanathan R.; Humphreys W.; Bailey B.; Josephs J. A Novel Detection Technology: Charged Aerosol Detection (CAD) Coupled with HPLC, UV, and LTQ-Orbitrap MS for Semi-Quantitation of Metabolites in Drug Discovery Metabolism Studies, ASMS oral presentation, Salt Lake City, May 2010.