Use of Charged Aerosol Detection as an Orthogonal Quantification Technique for Drug Metabolites in Safety Testing (MIST)

Význam tématu

Správná kvantifikace lidských metabolitů léčiv v raných fázích vývoje je zásadní pro splnění požadavků FDA MIST na bezpečnostní testování. Konvenční LC-MS metody nabízejí citlivou detekci, avšak variabilní ionizační účinnost limituje přesnost relativního kvantování. Charged Aerosol Detection (CAD) představuje komplementární přístup s uniformní odpovědí na všechny nevolatilní a mnohé semivolatilní sloučeniny, nezávislou na chemické struktuře nebo přítomnosti chromoforu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyhodnotit využití CAD jako ortogonální kvantifikační techniky pro metabolity dvou modelových léčiv (buspirone a erythromycin) po inkubaci s lidskými jaterními mikrozomy. Studie porovnala lineární rozsah, citlivost, reprodukovatelnost a schopnost detekovat i slabě chromoforové nebo bezchromoforové metabolity při srovnání s UV a vysokorychlostními MS přístupy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky buspironu a erythromycinu ve 4 koncentracích (1–100 µM) byly inkubovány s HLM, zastaveny acetonitrilem a analyzovány UHPLC na C18 kolóně (1,8 µm, 4,6×150 mm) s gradientem 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě/acetonitrilu. Celkový tok 1 mL/min byl splitován (~150 µL/min do MS, zbytek do CAD). Detekce probíhala současně:

• CAD (Corona Charged Aerosol Detector) s dusíkem (regulovaný tlak 35 psi, rozsah 100 pA)
• DAD (UltiMate 3000, vlnové délky 210–220 nm a 254 nm)
• HRMS (LTQ-Orbitrap, full scan, 1×DDS)

Hlavní výsledky a diskuse

U buspironu CAD vykázal reprodukovatelnost RSD ~20 % a lineární odezvu od ~4 ng do 124 ng na kolóně (R2=0,9994), LOD kolem 1 ng. Nízkofrekvenční UV při 254 nm byla méně spolehlivá (RSD až 53 %), MS RSD ~37 %. U erythromycinu CAD dokázal detekovat čtyři hlavní metabolity, které UV vůbec neodpovídaly. Klíčová byla optimalizace splitu toku a blízké umístění rozdělovače k MS (vnitřní průměr 0,004″). CAD jako univerzální detektor poskytuje konzistentní citlivost nezávislou na chromoforu.

Přínosy a praktické využití metody

CAD umožňuje:

• Rychlou a spolehlivou kvantifikaci metabolit i bez komerčních standardů či radiolabelovaných vzorků.
• Současné doplnění UV a MS dat pro vyšší důvěryhodnost výsledků.
• Snížení nákladů a času v raných fázích vývoje léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Aplikace CAD lze dále rozšířit:

• Normalizace MS dat pomocí CAD nebo UV pro nízké hladiny detekce (“MetPro” přístup).
• Optimalizace mikromycie a nižších průtoků pro zvýšení citlivosti.
• Automatizace a miniaturizace hyphenovaných systémů CAD-MS.
• Využití v in vivo studiích a monitorech čistoty výrobních linek (QA/QC).

Závěr

Implementace UHPLC-UV-CAD-MS poskytuje robustní, citlivou a ortogonální techniku kvantifikace metabolit v souladu s FDA MIST. CAD významně doplňuje tradiční detektory, zejména pro sloučeniny bez silného chromoforu, a zvyšuje spolehlivost vývojových studií bez výrazného navýšení nákladů nebo času.

Reference

1. Dependence of Response on Chemical Structure, ESA—A Dionex Company, Application Brief 70-8913 Rev B.
2. Cai H. et al.: Charged Aerosol Detection (CAD) Coupled with HPLC-UV and LTQ-Orbitrap MS for Semi-Quantitation of Metabolites, ASMS 2010.
3. Zhu W. et al.: Drug Metabolism and Disposition 2005, 33, 500–507.