LC-MS/MS Method for the Determination of Diclofenac in Human Plasma

Význam tématu

Determinace diklofenaku v lidské plazmě je zásadní pro monitorování léčebných koncentrací, hodnocení farmakokinetiky a zabezpečení kvality bioanalytických studií. Vysoce citlivé a specifické metody LC-MS/MS umožňují přesné stanovení nízkých hladin účinné látky v biologických matricích, což je klíčové v klinických farmakologických studiích, toxikologii i QA/QC laboratořích.

Cíle a přehled studie

Vyvinout rychlou a reprodukovatelnou metodiku pro extrakci a kvantifikaci diklofenaku v lidské plazmě s dosažením mezní kvantifikovatelné koncentrace (LOQ) 1 ng/mL a lineárního rozsahu 1–1000 ng/mL. Studie využívá technologii SOLA SPE pro efektivní přípravu vzorků a sloupce Accucore RP-MS pro ultrarychlou chromatografii.

Použitá metodika

Sample pretreatment:

• 200 µL plazmy, přídavek spiking a interní standard (diklofenac-d4)
• přidání 200 µL 70 % kyseliny mravenčí, promíchání

Extrakce SPE (Thermo Scientific SOLA 10 mg/1 mL):

• kondicionování: 0,5 mL methanolu, 0,5 mL vody
• nanesení vzorku
• oplach: 200 µL 90:10 (v/v) voda/methanol
• eluace: 2×200 µL acetonitrilu, sušení N2, rekonstituce v 100 µL 50:50 voda/acetonitril

LC podmínky:

• Sloupec Accucore RP-MS 2,6 µm, 50×2,1 mm, 40 °C
• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % kyseliny octové, B: acetonitril + 0,1 % kyseliny octové
• Gradient: 50 %→100 % B za 1 min, průtok 0,6 mL/min, objem injekce 20 µL

MS/MS podmínky:

• Thermo Scientific TSQ Vantage, HESI negativní mód
• přechody: diklofenac m/z 250,1→178,0/214,0; IS 254,1→217,0
• spray voltage 3000 V, vaporizer 300 °C, collision pressure 1,5 mTorr

Data processing: Thermo Scientific LCQuan.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific SOLA SPE cartridges/plates
• Thermo Scientific Accela 600 UHPLC
• Accucore RP-MS 2,6 µm sloupec
• Thermo Scientific TSQ Vantage MS
• Thermo Scientific UltraVap evaporátor
• 96-well plate vakuová manifold
• LCQuan software

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala lineární kalibraci v rozsahu 1–1000 ng/mL s koeficientem r2 0,999. Mezní kvantifikovatelná koncentrace (1 ng/mL) poskytla dobře definovaný chromatografický vrchol. Replicate QCs při 15 ng/mL ukázaly přesnost –2 % a precizi <4,4 % CV. Obnovitelnost (recovery) diklofenaku byla průměrně 85,8 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorků s nízkou spotřebou rozpouštědel
• Vysoká reprodukovatelnost a čistota extraktu
• Možnost vysoko-propustného bioanalytického provozu
• Vynikající citlivost a šířka lineárního rozsahu
• Vhodné pro klinické farmakokinetické studie a QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může vést k úplné automatizaci SPE procesů, miniaturizaci metodiky, integraci s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry a rozšíření aplikace na více analytů v jednom běhu. Dále je perspektivní adaptace na jiné biologické matrice a bezpapírovou dokumentaci v rámci laboratorních informačních systémů (LIMS).

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pomocí SOLA SPE a Accucore RP-MS nabízí rychlé, citlivé a přesné stanovení diklofenaku v plazmě s LOQ 1 ng/mL, obnovitelností >85 % a precizností <5 % CV. Metoda je ideální pro náročné bioanalytické aplikace v preklinických a klinických studiích.