Global In-Depth Quantitative Phosphoproteomic Analysis of HIV Infected Cells using the Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza fosfoproteomu poskytuje klíčové poznatky o signálních drahách hostitelských buněk po infekci HIV. Kvantifikace změn ve fosforylaci post-translačních modifikací umožňuje odhalit mechanizmy patogeneze HIV a identifikovat potenciální terapeutické cíle.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo globálně identifikovat a kvantifikovat změny fosfoproteomu lidských T buněk Jurkat po infekci virem HIV. K tomuto účelu byly buňky označeny metodou SILAC, obohaceny o fosfopeptidy pomocí HILIC/TiO2 a analyzovány na Orbitrap Fusion Tribrid MS s využitím nového rozhodovacího stromu pro ETD a CID.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer (Thermo Scientific)
• EASY-nLC 1000 s EASY-Spray zdrojem
• HILIC/TiO2 kolony pro enrich­ment fosfopeptidů
• Lineární ion trap, ultra vysoké rozlišení Orbitrap analyzátor, kvadrupólová izolace

Použitá metodika

Buňky Jurkat byly kultivovány ve „light“ a „heavy“ SILAC médiu a infikovány HIV nebo mock. Po lyzi a trávení trypsinem byly peptidy frakcionovány HILIC kolečky a obohaceny na TiO2. Liquid chromatography proběhla na 90min gradientu (5–22 % acetonitrilu) při 300 nL/min. Hmotová spektrometrie byla prováděna v režimu DDDT (ETD/CID) i klasicky CID, full scan v rozlišení 120 000, fragmenty detekovány v lineární pastičce.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda DDDT kombinující ETD a CID identifikovala výrazně více unikátních fosfopeptidů než samostatné CID. Lepší pokrytí fragmenty zlepšilo lokalizaci fosforylačních míst, zejména při více modifikacích. Analýza dat odhalila aktivaci aurora kináz po infekci HIV a potvrdila zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi prostřednictvím proteinů VIF a VPR. Data naznačují modulaci DNA damage response a Chk1-dependentní kontrolu cyklu.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoce citlivá a integrovaná metoda umožňuje detailní sledování fosfoproteomu v biologických systémech. Umožňuje rychlou akvizici dat s vysokým rozlišením pro kvantitativní srovnání stavů buněk za různých podmínek, vhodné pro QA/QC v průmyslové analýze, vývoj inhibitorů a výzkum virus–host interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj adaptivních metod akvizice využívajících rozhodovací stromy a strojové učení, integrace dalších typů fragmentace (např. UVPD) a širší aplikace v personalizované medicíně, studiu signálních sítí v infekčních a nádorových modelech.

Závěr

Orbitrap Fusion Tribrid MS ve spojení s DDDT metodou představuje výkonný nástroj pro hloubkovou kvantitativní fosfoproteomii. Identifikované fosforylační změny po HIV infekci nabízejí nové vhledy do patogeneze a potenciální terapeutické cíle.

Reference

1. Swaney DL, McAlister GC, Coon JJ. Nat Methods 2008, 5, 959.
2. Taus T, Kocher T, Pichler P, et al. J Proteome Res 2011, 10, 5354.
3. Beltrao P, Albanèse V, Kenner LR, et al. Cell 2012, 150, 413.
4. Sakai K, Dimas J, Lenardo MJ. PNAS USA 2006, 103, 3369.